Obsługa i stabilność oligonukleotydów
Oligonukleotydy DNA są stosunkowo stabilnymi cząsteczkami (Tabela 1). Wymagają jednak pewnych technik obsługi i przechowywania, aby zapewnić odpowiednio bezproblemowe eksperymenty i zmaksymalizować okres trwałości.
Tabela 1. Przybliżony okres trwałości niemodyfikowanych, jednoniciowych oligonukleotydów DNA przy prawidłowym przechowywaniu. Wartości te są szacunkowe i nie są gwarantowane.
Resuspensja, przechowywanie i nawyki robocze
Niezmodyfikowane DNA
Resuspensja. O ile nie zażądano dostarczenia w roztworze, wszystkie jednoniciowe oligonukleotydy DNA są dostarczane w stanie suchym i są gotowe do użycia po ponownym zawieszeniu, z wyjątkiem sekwencji modyfikowanych tiolem (postępuj zgodnie z tym protokół redukcji aby aktywować te oligonukleotydy). Preferowane są słabe bufory, takie jak TE (10 mM Tris, pH 7,5 do 8,0, 1 mM EDTA) lub Tris (10 mM Tris-HCl, pH 8,0), przy czym najlepszym wyborem jest TE. Jeśli TE jest nieodpowiedni dla końcowej techniki / zastosowania, drugim najlepszym wyborem jest sterylna woda wolna od nukleaz.
Przechowywanie. Jak pokazano w Tabeli 1, przechowywanie w temperaturze -20 °C zapewni najdłuższy okres trwałości. Bufor TE jest absolutnie najlepszą opcją, ponieważ woda laboratoryjna jest często lekko kwaśna, co powoli degraduje DNA. Ponadto suche oligo nigdy nie są naprawdę suche. Pewna ilość wilgoci zawsze pozostaje, co z kolei prowadzi do powolnej degradacji. Jednak jest mało prawdopodobne, aby istniała jakakolwiek znacząca różnica w stabilności przez co najmniej 2 lata, niezależnie od tego, czy są przechowywane w stanie suchym, w wodzie czy w buforze.
Niezmodyfikowane RNA
Resuspensja.Jednoniciowe oligonukleotydy RNA należy ponownie zawiesić w sposób opisany powyżej dla niemodyfikowanego DNA.
Przechowywanie. RNA jest znacznie bardziej niestabilny niż DNA ze względu na swoją strukturę chemiczną. RNA podlega autokatalizie (Rysunek 1), a także degradacji przez RNazy, które są powszechne w laboratoriach ze względu na ich obecność w źródłach takich jak złuszczone komórki skóry i wszechobecne mikroorganizmy.
Rysunek 1. Autokataliza RNA.Grupa 2'-hydroksylowa RNA może prowadzić do autokatalitycznej degradacji, co z kolei, w odpowiednich warunkach, obniża ilość użytecznego oligonukleotydu.
Dla krótkotrwałego przechowywania, jednoniciowe oligonukleotydy RNA powinny być przechowywane w buforze TE w temperaturze -80 °C. W przypadku przechowywania długoterminowego najlepszą opcją jest przechowywanie w temperaturze -80 °C w postaci osadu etanolu. Podjęcie środków ostrożności w celu zminimalizowania ekspozycji na RNazy wydłuży okres trwałości.
Praca z RNA. RNazy często zawierają liczne wiązania dwusiarczkowe i dlatego są bardzo stabilne. Bez użycia ostrych chemikaliów w celu wyeliminowania tych enzymów, są one odporne na powszechne metody odkażania, takie jak autoklawowanie. Poniższe środki ostrożności pomogą zminimalizować narażenie oligonukleotydów RNA na działanie RNaz:
- Zakładaj, że wszystko w twoim miejscu pracy / laboratorium jest zanieczyszczone RNazami.
- Używaj odizolowanej części laboratorium, która jest przeznaczona wyłącznie do pracy z RNA.
- Rutynowo czyść obszar izolacji RNA środkami, które niszczą RNazy.
- Używaj chemikaliów, odczynników i wody, które są certyfikowane jako wolne od RNaz.
- Używaj narzędzi, takich jak mikropipety, które są przeznaczone wyłącznie do pracy z RNA.
- Zawsze noś rękawiczki i zmieniaj je po dotknięciu innych powierzchni.
Modyfikowane oligonukleotydy
Resuspensja.Zmodyfikowane oligonukleotydy, czy to DNA czy RNA, powinny być ponownie zawieszone w buforze TE. Ma to krytyczne znaczenie, zwłaszcza w przypadku cząsteczek fluorescencyjnych, ponieważ pH może mieć duży wpływ na intensywność emisji fluorescencji.
Przechowywanie. Zmodyfikowane oligonukleotydy powinny mieć profile stabilności podobne do ich niezmodyfikowanych odpowiedników DNA i RNA. Dlatego powinny być przechowywane zgodnie z powyższymi zaleceniami dla DNA i RNA. Aby zapobiec fotobieleniu, znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydy powinny być przechowywane w ciemności.
Praca z modyfikacjami fluorescencyjnymi. Aby zapobiec fotobieleniu podczas pracy z cząsteczkami fluorescencyjnymi, należy przechowywać je w bursztynowych probówkach lub, jeśli są przenoszone do przezroczystych probówek, owinąć je folią.
Dupleksy oligonukleotydów
Nasi naukowcy odkryli, że dupleksy siRNA są stabilne przez co najmniej 3 lata, gdy są przechowywane w stanie suchym w temperaturze -20 °C. Dupleksy DNA powinny być równie stabilne, jeśli nie bardziej (Ta wartość jest szacunkowa i nie jest gwarantowana. Aby otrzymać eksperymentalnie określoną datę ważności z gwarancją, prosimy o zapytanie o badanie stabilności [poniżej] z nami).
Alikwoty jednorazowego użytku
.Podczas gdy uważa się, że cykle zamrażania / rozmrażania degradują genomowe DNA, prawdopodobnie poprzez ścinanie spowodowane tworzeniem się kryształów lodu1, nasi naukowcy odkryli, że takie cykle nie mają negatywnego wpływu na oligonukleotydy. Najlepszą praktyką jest jednak dozowanie oligonukleotydów do jednorazowych porcji, a następnie zamrażanie ich w temperaturze -20 °C. Zapobiega to marnotrawstwu z powodu nieszczęśliwych wypadków, takich jak zanieczyszczenie krzyżowe lub wycieki. Na przykład, jeśli rozlejesz pojedynczą tubkę oligonukleotydu na podłogę, będziesz musiał ją ponownie zamówić. Jeśli jednak rozlejesz pojedynczą porcję na podłogę, możesz po prostu rozmrozić inną probówkę.
Przygotowanie roztworów
.Ilość oligonukleotydów, znajdująca się zarówno na etykiecie probówki, jak i w arkuszu danych technicznych, jest podawana w różnych jednostkach, w tym gęstości optycznej (OD), mikrogramach (µg; rozszerzenie, µg/OD) i nanomolach (nmol). Nasza metoda kwantyfikacji rozpoczyna się od odczytu absorbancji przy 260 nm w spektrofotometrze UV/Vis, aby uzyskać wartość OD - wszystkie inne jednostki są wyprowadzane z tej wartości OD (aby dowiedzieć się więcej, zobacz Oligonucleotide Quantification). Te jednostki ilościowe - nmol jest najbardziej użyteczny - mogą być używane bezpośrednio do tworzenia roztworów podstawowych.
Istnieje wiele jednostek stężenia, ale mikromolar (µM) jest prawdopodobnie najczęściej używany z oligonukleotydami. Tutaj, zaczynając od już określonej ilości nmol znajdującej się na etykiecie probówki / w arkuszu danych technicznych, jako przykład zostaną przedstawione zarówno długie, jak i skrócone obliczenia potrzebne do utworzenia roztworu podstawowego o stężeniu 100 µM, a także roztworu roboczego o stężeniu 10 µM. Aby uzyskać szybsze wyniki, w tym obliczenie stężenia w innych jednostkach, należy skorzystać z modułów zawiesiny i rozcieńczenia OligoEvaluator™.
Przykładowe obliczenia resuspensji
Preferujemy pracę w jednostkach bazowych, aby zapobiec "pomyłkom konwersji" podczas analizy wymiarowej. Popełnianie błędów jest łatwe, gdy bezpośrednio próbujemy konwertować między nmol, µM i innymi jednostkami podstawowymi.
Krok 1. Przelicz liczbę nmol na etykiecie probówki / arkuszu danych technicznych na mole.
Nasz hipotetyczny oligonukleotyd przybywa z ilością 49,9 nmol.
mol = 49.9 nmol x 1 mol 109 nmol-1
mol = 4.99 x 10-8
Krok 2. Przelicz pożądane stężenie roztworu podstawowego wynoszące 100 µM na molarność.
100 µM = 100 µmol L-1
M (mol L-1) = 100 µmol L-1 x 1 mol 106 mol-1
M (mol L-1) = 1 x 10-4
Krok 3. Użyj pożądanego stężenia roztworu podstawowego w molarności i liczby moli, aby obliczyć objętość w litrach potrzebną do ponownego zawieszenia.
1 x 10-4 mol L-1 = 4.99 x 10-8mol
L = 4.99 x 10-8mol / 1 x 10-4mol
L = 4.99 x 10-4
Krok 4. Przelicz litry na mikrolitry (µL).
Objętość = 4.99 x 10-4 L x 106 µL L-1
Objętość = 4.99 µL
Przykładowe skrócone obliczenie zawiesiny
Krok 1. Weź liczbę nmol z etykiety probówki / arkusza danych technicznych i pomnóż przez 10, aby uzyskać objętość zawiesiny w mikrolitrach.
Objętość = 4.99 nmol x 10
Objętość = 499 .µL
Ten skrót obliczeniowy działa tylko w przypadku tworzenia roztworów 100 µM.
W tym konkretnym przypadku należy dodać 499 µL wody lub buforu do probówki zawierającej oligonukleotyd, a następnie worteksować, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie.
Dodatkowe przemyślenia na temat resuspensji
W powyższym przykładzie resuspensji użyto 100 µM, ponieważ jest to typowe laboratoryjne stężenie roztworu podstawowego. Tworzenie roztworów podstawowych o stężeniach zbytnio poniżej 100 µM może być problematyczne, ponieważ objętość potrzebna do ponownego zawieszenia może z łatwością przekroczyć 2 ml pojemności probówki. Na przykład, aby utworzyć roztwór podstawowy o stężeniu 20 µM, do tego konkretnego oligonukleotydu o stężeniu 49,9 nmol należałoby dodać 2,49 ml wody lub buforu.
Podobnie, próba utworzenia roztworu podstawowego o stężeniu większym niż 100 µM również może być problematyczna. Na przykład, aby utworzyć roztwór podstawowy o stężeniu 1000 µM, ten konkretny oligonukleotyd potrzebowałby 49,9 µL wody lub buforu. Tak mała objętość może być trudna do dokładnego odpipetowania z probówki o pojemności 2 ml.
Aby utworzyć roztwór podstawowy o stężeniu 100 µM, obliczenia i narzędzia online są w rzeczywistości niepotrzebne, ponieważ objętość potrzebna do ponownego zawieszenia jest zawarta w arkuszu danych technicznych.
Przykładowe obliczenia roztworu roboczego
W tym przykładzie założymy, że końcowy roztwór roboczy 10 µM ma mieć objętość 20 µL, co jest typowe dla PCR.
Krok 1. Użyj tej formuły równoważności stężenia i objętości.
C1V1 = C2V<2
100 µM x V1 = 10 µM x 20 µL
V1 = 2 µL
W tym konkretnym przypadku należy dodać 2 µL roztworu podstawowego do probówki reakcyjnej i wraz z innymi składnikami doprowadzić końcową objętość za pomocą wody lub buforu do 20 µL.
Weryfikacja ilości
Dbamy o to, aby nasze wartości OD były dokładne. Jednak nadal możesz chcieć zweryfikować ilość swojego oligonukleotydu. W takim przypadku, jeśli posiadasz tradycyjny spektrofotometr UV/Vis, metoda jest prosta.
Postępuj zgodnie z następującymi krokami:
- Zawieś oligonukleotyd w 400 µL wody lub buforu.
- Rozcieńczyć 12 µL w 988 µL sterylnej, wolnej od nukleaz wody.
- Odczytać A260 1 ml próbki w kuwecie.
- Upewnij się, że wartość OD mieści się w zakresie liniowym (~0,1 do 1 OD).
- Pomnóż OD objętości próbki przez współczynnik rozcieńczenia.
Całkowita OD = OD 1 mL próbki X 400/12 - Pomnóż całkowitą OD przez µg/OD (z arkusza danych technicznych), aby uzyskać µg.
Wnioski
Nawet przy złym traktowaniu, większość jednoniciowych oligonukleotydów DNA jest wystarczająco stabilna, aby dobrze funkcjonować, jeśli są używane wkrótce po dostarczeniu. Jeśli potrzebna jest dodatkowa pomoc, prosimy o kontakt z naszą grupą ds. usług technicznych pod adresem oligotechserv@sial.com.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?