GenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit Protocol ;
Opis produktu
Zestaw GenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit zapewnia prosty i wygodny sposób izolacji czystego genomowego DNA z różnych hodowanych komórek, tkanek (w tym ogonów gryzoni) oraz świeżej krwi pełnej lub białych krwinek. Zestaw łączy zalety wiązania krzemionki z formatem mikrospinowym i eliminuje potrzebę stosowania drogich żywic, wytrącania alkoholu i niebezpiecznych związków organicznych, takich jak fenol i chloroform. Materiały wyjściowe są lizowane w chaotropowym roztworze zawierającym sól, aby zapewnić dokładną denaturację makrocząsteczek. Dodanie etanolu powoduje wiązanie DNA, gdy lizat jest odwirowywany przez membranę krzemionkową w probówce do mikrowirówki. Po przemyciu w celu usunięcia zanieczyszczeń, DNA jest eluowane w 200 µl roztworu Tris-EDTA.
Oczekiwana wydajność genomowego DNA będzie się różnić w zależności od ilości i rodzaju użytego materiału wyjściowego (na przykład, 15-25 µg DNA poddanego działaniu RNazy A można wyizolować z 2 x 106 komórek HeLa w czasie krótszym niż jedna godzina). DNA oczyszczone za pomocą zestawu ma stosunek A260/A280 między 1,6 a 1,9 i może mieć długość do 50 kb. To DNA jest gotowe do dalszych zastosowań, takich jak trawienie endonukleazą restrykcyjną, PCR, Southern blots i reakcje sekwencjonowania
Odczynniki i sprzęt wymagane, ale niedostarczane
- Łaźnia wodna 55 °C lub łaźnia wodna z wytrząsaniem
- Łaźnia wodna 70 °C lub blok grzejny
- - Końcówki do pipet z barierą aerozolową (zalecane)
- 1.Probówka do mikrowirówki 5 mL do lizy
- Mikrowirówka (probówka 2 mL, wyposażona w rotor)*
- Etanol (95-100%), nr kat. E7148, E7023 lub 459836
- Woda odczynnikowa do biologii molekularnej, nr katalogowy W4502
*Uwaga: Aby zapewnić prawidłowe dopasowanie wszystkich probówek, zaleca się stosowanie 24-miejscowego rotora. Jeśli używasz rotora
36-miejscowego, zalecamy użycie co drugiego miejsca w celu prawidłowego dopasowania probówek
Przechowywanie i stabilność
Przechowywać zestaw w temperaturze pokojowej. Jeśli jakikolwiek odczynnik zestawu utworzy osad, podgrzać w temperaturze 55-65 °C do rozpuszczenia osadu i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed użyciem.
Instrukcja przygotowania
Przed rozpoczęciem procedury należy wykonać następujące czynności:
1. Rozgrzać łaźnię wodną lub łaźnię wodną z wytrząsaniem do temperatury 55°C
Do użytku z tkankami, ogonami gryzoni, świeżą krwią pełną i białymi krwinkami.
2. Rozgrzać łaźnię wodną lub blok grzejny do temperatury 70°C
Do użytku z hodowanymi komórkami i tkankami.
3. Dokładnie wymieszać odczynniki
Sprawdzić odczynniki pod kątem wytrącania się osadu. Jeśli jakikolwiek odczynnik tworzy osad, podgrzać w temperaturze 55-65°C do rozpuszczenia osadu i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed użyciem.
4. Rozcieńczyć koncentrat roztworu płuczącego
Rozcieńczyć koncentrat za pomocą 10 ml (10 opakowań wstępnych), 80 ml (70 opakowań wstępnych) lub 360 ml (350 opakowań wstępnych) 95-100% etanolu. Po każdym użyciu szczelnie zamknąć rozcieńczony roztwór do płukania, aby zapobiec odparowaniu etanolu.
5. Rozpuścić Proteinazę K w wodzie
Zgodnie z Tabelą 1 poniżej, rozpuścić proszek w jednej butelce Proteinazy K w wodzie (nr katalogowy W4502), aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 20 mg/ml. Roztwór ten można przechowywać przez kilka dni w temperaturze 2-8 °C. W przypadku dłuższego przechowywania, niewykorzystana część roztworu może być przechowywana w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebna. Dostarczony produkt jest stabilny w temperaturze pokojowej.
Roztwór proteinazy K należy za każdym razem dodawać bezpośrednio do każdej przygotowywanej próbki. Nie należy łączyć roztworu proteinazy K i roztworu do lizy w celu przechowywania.
Procedura
Uwaga: Jeśli minimalnie ścinane genomowe DNA jest pożądane w dalszych zastosowaniach, np, w przypadku użycia produktu końcowego do długiej amplifikacji PCR, należy mieszać za pomocą delikatnego pipetowania lub odwracania do uzyskania jednorodności zamiast worteksowania w poniższej procedurze.
A. Przygotowanie hodowanych komórek
1a. Zbierz komórki
- Dołączone hodowle komórkowe: Uwolnić komórki za pomocą trypsyny. Peelingować do 5 × 106 komórek przez 5 minut z prędkością 300 × g; całkowicie usunąć pożywkę i wyrzucić. Przejść do kroku 2a.
- Hodowle komórek w zawiesinie: Peelingować do 5 × 106 komórek przez 5 minut przy 300 × g; całkowicie usunąć pożywkę i odrzucić. Kontynuować krok 2a.
Uwaga: Komórki można zebrać, podzielić na porcje do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w temperaturze -70°C przez kilka miesięcy przed przygotowaniem DNA.
2a. Ponownie zawiesić komórki
Dokładnie zawiesić osad w 200 µL roztworu do ponownego zawieszania. W przypadku wcześniejszego zamrożenia, przed ponownym zawieszeniem pozwolić na lekkie rozmrożenie osadu komórek. Jeśli pozostałości RNA nie stanowią problemu, kontynuuj krok 3a.
Opcjonalna obróbka RNazą A: Jeśli wymagane jest genomowe DNA wolne od RNA, dodać 20 µL roztworu RNazy A i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie kontynuować krok 3a.
3a. Dodać 20 µL roztworu Proteinazy K do próbki, a następnie 200 µL Roztworu do Lizy C (B8803). Dokładnie wymieszać (około 15 sekund) i inkubować w temperaturze 70°C przez 10 minut. Jednorodna mieszanina jest niezbędna do skutecznej lizy. Kontynuować krok 4.
Rysunek 1. Genomowe DNA oczyszczone z komórek przy użyciu zestawu GenElute™ Mammalian Genomic DNA Purification Kit. Oczyszczone genomowe DNA wyizolowano za pomocą zestawu GenElute™ Mammalian Genomic DNA Purification Kit z 2 x 106 komórek ze wskazanych źródeł. Genomowe DNA (200 ng/pas) analizowano na 0,8% żelu agarozowym. Markery to DNA lambda trawione Hind III.
B. Przygotowanie tkanek ssaków
1b. Przygotuj tkankę
Szybko rozdrobnij i zważ kawałek świeżej lub zamrożonej tkanki. Pozwól zamrożonej tkance lekko rozmrozić się przed pokrojeniem, ale trzymaj ją w lodzie, aby chronić przed degradacją. Cięcie tkanki na małe kawałki umożliwia bardziej wydajną lizę. Do jednego preparatu można użyć do 25 mg tkanki (lub 10 mg śledziony, ze względu na dużą liczbę komórek w danej masie). Przenieść do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i przejść do kroku 2b.
Uwaga: Tkanka może być pobrana, podzielona na porcje do probówek mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i błyskawicznie zamrożona w ciekłym azocie, a następnie przechowywana w temperaturze -70°C przez kilka miesięcy przed przygotowaniem DNA.
2b. Trawić tkankę
Dodać 180 µl Roztworu do Lizy T (B6678), a następnie 20 µl roztworu Proteinazy K do tkanki. Wymieszać przez worteksowanie. Inkubować próbkę w temperaturze 55°C, aż tkanka zostanie całkowicie strawiona i nie pozostaną żadne cząstki. Worteksuj od czasu do czasu lub użyj łaźni wodnej z wytrząsaniem. Trawienie jest zwykle zakończone w ciągu 2 do 4 godzin. Po zakończeniu trawienia, krótko worteksować.
Opcjonalna obróbka RNazą A: Jeśli pozostałości RNA nie stanowią problemu, kontynuować krok 3b. Jeśli wymagane jest genomowe DNA wolne od RNA, dodaj 20 µL roztworu RNazy A i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przejdź do kroku 3b.
3b. Liza komórek
Dodać 200 µL Roztworu do Lizy C (B8803) do próbki; dokładnie worteksować (15 sekund). Jednorodna mieszanina jest niezbędna do skutecznej lizy. Inkubować w temperaturze 70°C przez 10 minut. Kontynuować krok 4.
Rysunek 2. Genomowe DNA oczyszczone z tkanek przy użyciu zestawu GenElute™ Mammalian Genomic DNA Purification Kit. Oczyszczone genomowe DNA ze wskazanych tkanek myszy wyizolowano za pomocą zestawu GenElute™ Mammalian Genomic DNA Purification Kit. Genomowe DNA (200 ng/pas) analizowano na 0,8% żelu agarozowym w celu zilustrowania wydajności i integralności. Markery to DNA lambda trawione za pomocą Hind III.
C. Przygotowanie ogona gryzonia
1c. Przygotuj ogony gryzoni
Szybko odmierz i odetnij kawałek świeżego lub mrożonego ogona gryzonia. Pozwól zamrożonemu ogonowi gryzonia lekko się rozmrozić przed cięciem, ale trzymaj go na lodzie, aby chronić go przed degradacją. Nie używaj więcej niż 0,6 cm (szczur) lub 1,2 cm (mysz) ogona na preparat. Odetnij dwa (mysz) lub jeden (szczur) ogon o długości 0,5-0,6 cm i umieść je w 1,5 ml probówce do mikrowirówki; przejdź do kroku 2c.
Uwaga: Ogony gryzoni mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy przed przygotowaniem DNA.
2c. Trawić tkankę
Dodać 180 µL Roztworu do Lizy T (B6678), a następnie 20 µL roztworu Proteinazy K do ogona gryzonia. Wymieszać przez worteksowanie; upewnić się, że ogon jest całkowicie zanurzony. Inkubować próbkę w temperaturze 55 °C, aż tkanka ogona zostanie całkowicie strawiona. Niektóre cząstki (kości i włosy) mogą pozostać. Od czasu do czasu worteksuj lub użyj łaźni wodnej z wytrząsaniem podczas inkubacji, aby przyspieszyć trawienie. Trawienie jest zwykle zakończone w ciągu 3 do 6 godzin. Po zakończeniu trawienia, krótko worteksować. Jeśli pozostałości RNA nie stanowią problemu, przejdź do kroku 3.
Opcjonalna obróbka RNazą A: Jeśli wymagane jest genomowe DNA wolne od RNA, dodaj 20 µL roztworu RNazy A i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej; przejdź do kroku 3c.
3c. Liza komórek
Dodać 200 µL Roztworu do Lizy C (B8803) do próbki; dokładnie worteksować (15 sekund). Jednorodna mieszanina jest niezbędna do skutecznej lizy. Kontynuować krok 4.
D. Przygotowanie krwi pełnej
1d. Pobrać krew
Pobrać krew pełną do probówki z antykoagulantem (preferowana jest probówka z EDTA). Krew pełna powinna być wyrównana do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem przygotowania.
2d. Przygotować krew
Umieścić 20 µL roztworu proteinazy K w 1,5 µL probówce do mikrowirówki. Dodać do 200 µL próbki krwi pełnej do probówki. Jeśli próbka jest mniejsza niż 200 µL, dodaj roztwór do ponownego zawieszania, aby zwiększyć objętość do 200 µL.
Uwaga: Jeśli próbka jest już dozowana do probówki, roztwór proteinazy K można dodać do próbki. Worteksować, aby zapewnić dokładne wymieszanie enzymu. Krew pełną można przechowywać w temperaturze 4°C przez kilka godzin przed przygotowaniem DNA. Jeśli pozostałości RNA nie stanowią problemu, przejdź do kroku 3d.
Opcjonalna obróbka RNazą A: Jeśli wymagane jest genomowe DNA wolne od RNA, dodaj 20 µL roztworu RNazy A i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej; przejdź do kroku 3d.
3d. Liza komórek
Dodaj 200 µL Roztworu do Lizy C (B8803) do próbki; dokładnie worteksuj (15 sekund). Jednorodna mieszanina jest niezbędna do skutecznej lizy. Inkubować w temperaturze 55°C przez 10 minut. Kontynuować krok 4.
E. Przygotowanie białych krwinek (WBC)
1e. Przygotuj białe krwinki z krwi pełnej
Przygotuj WBC z 500 µL krwi pełnej na preparat; Dodatek do procedury lizy chlorkiem amonu.
2e. Ponownie zawiesić komórki
Dokładnie zawiesić osad w 200 µL roztworu do ponownego zawieszania; dodać 20 µL roztworu proteinazy K do próbki i krótko worteksować, aby zapewnić dokładne wymieszanie enzymu. Jeśli pozostałości RNA nie stanowią problemu, kontynuować od kroku 3e.
Opcjonalna obróbka RNazą A: Jeśli wymagane jest genomowe DNA wolne od RNA, dodać 20 µL roztworu RNazy A i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie kontynuować krok 3e.
3e. Liza komórek
Dodać 200 µl Roztworu do Lizy C (B8803) do próbki; dokładnie wymieszać. Jednorodna mieszanina jest niezbędna do skutecznej lizy. Inkubować w temperaturze 55°C przez 10 minut. Kontynuować krok 4.
Izolacja DNA ze wszystkich wymienionych typów próbek
Jest to kontynuacja procedury z próbek przygotowanych w sekcjach A, B, C, D i E.
4. Przygotowanie kolumny
Dodaj 500 µL roztworu przygotowującego kolumnę do każdej wstępnie zmontowanej kolumny wiążącej GenElute™ Miniprep (z czerwonym o-ringiem, nie mylić z innymi zestawami GenElute™) i odwiruj z prędkością 12,000 × g przez 1 minutę. Odrzuć przepływającą ciecz.
Uwaga: Roztwór przygotowujący kolumnę maksymalizuje wiązanie DNA z membraną, co skutkuje bardziej spójną wydajnością.
5. Przygotować do wiązania
Dodać 200 µl etanolu (95-100%) do lizatu; dokładnie wymieszać przez worteksowanie przez 5-10 sekund. Niezbędne jest uzyskanie jednorodnego roztworu.
6. Załadować lizat
Przenieść całą zawartość probówki do poddanej obróbce kolumny wiążącej z kroku 4. Użyj końcówki pipety o szerokim otworze, aby zmniejszyć ścinanie DNA podczas przenoszenia zawartości do kolumny wiążącej. Wirować z prędkością ≥6500 × g przez 1 minutę. Wyrzucić probówkę zbiorczą zawierającą przepływającą ciecz i umieścić kolumnę wiążącą w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
7. Pierwsze płukanie
Przed pierwszym użyciem rozcieńczyć koncentrat roztworu płuczącego etanolem zgodnie z opisem w części Instrukcje przygotowania. Dodać 500 µL roztworu płuczącego do kolumny wiążącej i wirować przez 1 minutę z prędkością ≥6 500 × g. Wyrzucić probówkę zbiorczą zawierającą ciecz przepływową i umieścić kolumnę wiążącą w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
8. Drugie płukanie
Dodać kolejne 500 µl roztworu płuczącego do kolumny wiążącej; wirować przez 3 minuty z maksymalną prędkością (12 000-16 000 × g), aby osuszyć kolumnę wiążącą. Kolumna wiążąca musi być wolna od etanolu przed elucją DNA. Jeśli widoczne są pozostałości etanolu, odwiruj kolumnę przez dodatkową minutę z maksymalną prędkością. Możesz opróżnić i ponownie użyć probówki zbiorczej, jeśli potrzebujesz tego dodatkowego etapu wirowania. Na koniec wyrzucić probówkę zbierającą zawierającą przepływającą ciecz i umieścić kolumnę wiążącą w nowej probówce zbierającej o pojemności 2 ml.
9. Elucja DNA
Odmierzyć pipetą 200 µL roztworu elucyjnego bezpośrednio do środka kolumny wiążącej; wirować przez 1 minutę z prędkością ≥6 500 × g w celu elucji DNA. Aby zwiększyć wydajność elucji, inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej po dodaniu Roztworu do elucji, a następnie odwirować.
Opcjonalnie: Druga elucja może zostać zebrana poprzez powtórzenie kroku 9 z dodatkowymi 200 µL Roztworu Elucyjnego i elucję do nowej probówki zbierającej o pojemności 2 ml (dostarczonej) lub do tej samej probówki zbierającej o pojemności 2 ml, która została użyta do pierwszego eluatu.
Eluat zawiera czyste genomowe DNA. Do krótkotrwałego przechowywania DNA zaleca się temperaturę 2-8 °C. Do długoterminowego przechowywania DNA zaleca się -20 °C. Należy unikać zamrażania i rozmrażania, które powodują pęknięcia nici DNA. Roztwór do elucji pomoże ustabilizować DNA w tych temperaturach.
Wytrącanie DNA (opcjonalnie)
Zestaw GenElute™ Mammalian Genomic DNA Kit został zaprojektowany tak, aby DNA zawsze pozostawało w roztworze, unikając w ten sposób problemów związanych z ponownym zawieszeniem. Jeśli jednak okaże się konieczne zagęszczenie DNA, zaleca się wytrącanie etanolem w obecności octanu sodu.
Wyniki
Stężenie i jakość genomowego DNA przygotowanego za pomocą zestawu GenElute™ można określić za pomocą analizy spektrofotometrycznej i elektroforezy w żelu agarozowym. Rozcieńczyć DNA w buforze TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0-8,5) i zmierzyć absorbancję przy 260 nm i 280 nm przy użyciu mikrokuwety kwarcowej. Absorbancja powinna wynosić od 0,1 do 1,0 (lub mieścić się w zakresie liniowym spektrofotometru). Absorbancja 1,0 przy 260 nm odpowiada około 50 µg/ml dwuniciowego DNA. Stosunek absorbancji przy 260 nm do 280 nm (A260/A280) powinien wynosić 1,6-1,9. Rozmiar i jakość DNA można określić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.1 Żel zawierający 0,8% agarozę (nr katalogowy A9539) w 0,5-krotnym buforze TBE (nr katalogowy T6400) dobrze nadaje się do rozdzielczości genomowego DNA. DNA może być wizualizowane przez barwienie barwnikiem interkalującym, takim jak bromek etydyny (nr katalogowy E1510) i mierzone względem znanego markera DNA, takiego jak Lambda DNA EcoRI Hind III digest (nr katalogowy D9281). Genomowe DNA powinno migrować jako pojedyncze pasmo o wysokiej masie cząsteczkowej z bardzo niewielkimi oznakami ścinania. Bardziej precyzyjne określenie wielkości DNA można wykonać za pomocą elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym.
Poradnik rozwiązywania problemów
1. Kolumna wiążąca jest zatkana
Przyczyna - Próbka jest zbyt duża.
Rozwiązanie - W przyszłości użyj mniejszej liczby komórek, mniejszych kawałków tkanki, mniejszych kawałków ogona gryzonia lub mniejszej ilości pełnej krwi. Aby uratować obecny preparat, zwiększ siłę g i/lub wiruj dłużej, aż lizat przejdzie przez kolumnę wiążącą. Wydajność genomowego DNA może być zmniejszona.
Przyczyna - Tkanka lub ogon gryzonia są nieskutecznie rozbijane.
Rozwiązanie - Przedłużyć trawienie Proteinazą K w temperaturze 55 °C. Aby przyspieszyć lizę, pokrój tkankę lub ogon gryzonia na mniejsze kawałki i często mieszaj podczas trawienia, aby zapewnić bardziej wydajną lizę. Odwrócenie probówki z próbką po trawieniu Proteinazą K zapewni bardziej jednorodną mieszaninę. Nie używaj połączonego roztworu (Proteinase K + Lysis Solution), który był przechowywany.
2. Niska wydajność genomowego DNA
Przyczyna - Próbka może być stara lub zdegradowana LUB Tkanka jest nieskutecznie rozbita.
Rozwiązanie - Wydajność będzie różna dla różnych typów komórek, tkanek i świeżej krwi pełnej. Używaj hodowli zanim osiągną maksymalną gęstość lub gdy staną się w pełni konfluentne. Zbieraj tkanki lub ogony gryzoni tak szybko, jak to możliwe. Użyj krwi pełnej w ciągu kilku godzin. Jeśli próbki są przechowywane do wykorzystania w przyszłości, zamroź komórki lub tkanki w ciekłym azocie. Krew pełną należy przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 12 godzin.
Przyczyna - Mieszanina lizatu/etanolu nie jest jednorodna.
Roztwór - Aby zapewnić jednorodny roztwór, należy worteksować 5-10 sekund przed nałożeniem na kolumnę wiążącą. Jeśli w dalszych zastosowaniach pożądane jest minimalne ścinanie genomowego DNA, np. w przypadku użycia produktu końcowego do długiej amplifikacji PCR, wymieszać za pomocą delikatnego pipetowania lub odwracania do uzyskania jednorodności zamiast worteksowania.
Przyczyna - Mieszanina lizatu/etanolu nie jest jednorodna.
Rozwiązanie - Aby zapewnić jednorodny roztwór, worteksować 5-10 sekund przed nałożeniem na kolumnę wiążącą. Jeśli pożądane jest minimalne ścinanie genomowego DNA w dalszych zastosowaniach, np. w przypadku stosowania produktu końcowego do długiej amplifikacji PCR, należy mieszać za pomocą delikatnego pipetowania lub odwracania do uzyskania jednorodności zamiast worteksowania.
Przyczyna - Elucja DNA jest niekompletna.
Rozwiązanie - Sprawdź, czy DNA zostało eluowane w 200 µL roztworu elucyjnego. Wydajność DNA dla większości rodzajów materiału można poprawić przez inkubację roztworu elucyjnego przez 5 minut w temperaturze pokojowej po dodaniu go do kolumny. Można przeprowadzić drugą i trzecią elucję przy użyciu 200 µL Roztworu Elucyjnego.
Przyczyna - Etanol został pominięty podczas wiązania.
Rozwiązanie - Sprawdź, czy etanol został dodany w kroku 5 przed nałożeniem próbki na kolumnę wiążącą w kroku 6.
Przyczyna - Eluat zawiera pozostałości etanolu z roztworu płuczącego.
Rozwiązanie - Etanol z końcowego płukania musi zostać usunięty przed elucją DNA. Wirować dłużej lub drugi raz, aby wysuszyć membranę. Jeśli przepływająca ciecz zawierająca etanol styka się z kolumną wiążącą, powtórz etap wirowania przed elucją DNA.
Przyczyna - Eluat zawiera pozostałości etanolu z roztworu płuczącego.
Rozwiązanie - Etanol z końcowego płukania musi zostać usunięty przed elucją DNA. Wirować dłużej lub drugi raz, aby wysuszyć membranę. Jeśli przepływająca ciecz zawierająca etanol styka się z kolumną wiążącą, powtórz etap wirowania przed elucją DNA.
Przyczyna - Eluat zawiera pozostałości etanolu z roztworu płuczącego.
Rozwiązanie - Etanol z końcowego płukania musi zostać usunięty przed elucją DNA. Wirować dłużej lub drugi raz, aby wysuszyć membranę. Jeśli przepływająca ciecz zawierająca etanol styka się z kolumną wiążącą, powtórz etap wirowania przed elucją DNA.
Przyczyna - Koncentrat roztworu płuczącego nie został rozcieńczony przed użyciem.
Rozwiązanie - Sprawdź, czy koncentrat roztworu płuczącego został prawidłowo rozcieńczony etanolem przed użyciem.
Przyczyna - Koncentrat roztworu płuczącego nie został rozcieńczony przed użyciem.
Rozwiązanie - Sprawdź, czy koncentrat roztworu do płukania został prawidłowo rozcieńczony etanolem przed użyciem.
Przyczyna - DNA eluowano wodą zamiast roztworem elucyjnym.
Rozwiązanie - Roztwór elucyjny jest zalecany do uzyskania optymalnej wydajności i przechowywania oczyszczonego DNA. Jeśli do elucji DNA używana jest woda, należy upewnić się, że pH wynosi co najmniej 7,0, aby uniknąć kwaśnych warunków, które mogą poddać DNA hydrolizie kwasowej podczas przechowywania przez długi czas.
3.Czystość DNA jest niższa niż oczekiwano; stosunek A260/A280 jest zbyt niski
Przyczyna - Próbka została rozcieńczona w wodzie.
Rozwiązanie - Użyj roztworu elucyjnego (10 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0) lub 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-8,5 jako eluentu.
Przyczyna - Odczyt tła jest wysoki z powodu drobin krzemionki.
Rozwiązanie - Wiruj próbkę DNA z maksymalną prędkością przez 1 minutę; użyj supernatantu do powtórzenia odczytów absorbancji.
4.Czystość DNA jest niższa niż oczekiwana; współczynnik A260/A280 jest zbyt wysoki
Przyczyna - Genomowe DNA jest zanieczyszczone RNA.
Rozwiązanien - Uwzględnij etap traktowania RNazą A w przyszłych izolacjach lub potraktuj produkt końcowy roztworem RNazy A i ponownie oczyszczaj.
5. DNA jest ścinane
Przyczyna - Genomowe DNA było traktowane nieprawidłowo.
Rozwiązanie - Ten zestaw został zaprojektowany w celu wyeliminowania wytrącania DNA i typowych etapów resuspensji występujących w innych zestawach genomowego DNA, które mogą prowadzić do ścinania. Wszystkie etapy pipetowania powinny być wykonywane tak delikatnie, jak to możliwe. Zaleca się stosowanie końcówek do pipet z szerokim otworem, aby wyeliminować ścinanie. Jeśli minimalnie ścinane genomowe DNA jest pożądane w dalszych zastosowaniach, np, w przypadku użycia produktu końcowego do długiej amplifikacji PCR, należy mieszać za pomocą delikatnego pipetowania lub odwracania do uzyskania jednorodności zamiast worteksowania.
Przyczyna - Próbka jest stara, zdegradowana lub została poddana wielokrotnym cyklom zamrażania/rozmrażania.
Rozwiązanie - Stary materiał wyjściowy może powodować degradację DNA w eluacie. Świeże komórki i tkanki, ogon gryzonia i preparaty pełnej krwi powinny być użyte natychmiast. Alternatywnie, komórki i tkanki mogą być zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -70 °C do czasu ich użycia. Ogony gryzoni mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni lub -70 °C przez kilka miesięcy. Krew pełną można przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 12 godzin.
6. Dalsze zastosowania są zahamowane
Przyczyna - Etanol jest przenoszony do końcowego preparatu genomowego DNA.
Rozwiązanie - Po końcowym płukaniu kolumny wiążącej (krok 8) nie dopuścić do kontaktu przepływającej cieczy z kolumną. Ponownie wirować kolumnę, jeśli to konieczne, po opróżnieniu probówki zbierającej, przez dodatkową 1 minutę z maksymalną prędkością (12 000-16 000 × g).
Przyczyna - Sól jest przenoszona do końcowego preparatu genomowego DNA.
Roztwór - Upewnij się, że kolumna wiążąca została przeniesiona do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml przed dodaniem roztworu płuczącego w kroku 8.
.
Załącznik: Procedura lizy chlorkiem amonu do izolacji białych krwinek z krwi pełnej
1. Pobrać krew pełną do probówki z antykoagulantem.
2. Dodaj 500 µl krwi pełnej do 1 ml roztworu lizującego chlorku amonu*. Delikatnie mieszać (przez odwracanie lub na kołysce stołowej) w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie wirować przez 5 minut z prędkością 700 × g w mikrowirówce.
3. Odrzucić supernatant. Delikatnie ponownie zawiesić osad w jednym dodatkowym ml roztworu lizującego chlorku amonu; delikatnie wymieszać i odwirować jak w kroku 2. Odrzucić supernatant, zachować osad komórek na lodzie i wznowić protokół krwinek białych (1e).
*Roztwór do lizy chlorku amonu:
160 mM chlorek amonu (nr katalogowy A9434), 20 mM wodorowęglan sodu (nr katalogowy S7277); pH do 7,2 z HCl.
Środki ostrożności i wyłączenie odpowiedzialności
Zestaw GenElute™ Mammalian Genomic DNA Kit jest przeznaczony wyłącznie do użytku laboratoryjnego, a nie do celów farmaceutycznych, domowych lub innych. Roztwór do lizy C zawiera sól chaotropową, która jest substancją drażniącą. Roztwór do przygotowania kolumn jest drażniący. Unikać kontaktu ze skórą. Podczas pracy z tymi roztworami lub jakimkolwiek odczynnikiem dostarczonym z zestawem należy nosić rękawice, okulary ochronne i odpowiednią odzież ochronną. Należy zapoznać się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (SDS) w celu uzyskania informacji na temat zagrożeń i bezpiecznego obchodzenia się z produktem.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?