Protokół zestawu GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit
(NA2100, NA2110, NA2120)

Opis zestawu GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit

Nasz zestaw GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit zapewnia prosty i wygodny sposób izolacji czystego DNA z różnych hodowanych bakterii. Zestaw zawiera wszystkie odczynniki potrzebne do izolacji i oczyszczania genomowego DNA z bakterii Gram-ujemnych. W przypadku większości bakterii Gram-dodatnich zestaw musi być używany w połączeniu z opcjonalnym lizozymem (L4919), aby skutecznie lizować grube ściany komórkowe peptydoglikanu. Roztwór do lizy bakterii Gram-dodatnich jest dostarczany jako rozcieńczalnik do przygotowywania roztworów podstawowych lizozymu.

Zestaw GenElute™ łączy zalety systemu opartego na krzemionce z formatem mikrospinowym i eliminuje potrzebę stosowania drogich żywic, wytrącania alkoholu i niebezpiecznych związków organicznych, takich jak fenol i chloroform. Bakterie są lizowane w chaotropowym roztworze zawierającym sól, aby zapewnić dokładną denaturację makrocząsteczek. Dodatek etanolu powoduje wiązanie DNA, gdy lizat jest odwirowywany przez membranę krzemionkową do probówki mikrowirówki. Po przemyciu w celu usunięcia zanieczyszczeń, DNA jest eluowane w 200 μl roztworu Tris-EDTA.

Oczekiwana wydajność genomowego DNA będzie się różnić w zależności od gęstości komórek kultury bakteryjnej oraz użytego gatunku i szczepu bakterii. W Załączniku 2 wymieniono typową wydajność genomowego DNA oczyszczonego z niektórych bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich. DNA oczyszczone za pomocą zestawu GenElute™ ma stosunek A₂₆₀/ A₂₈₀ między 1,6 a 1,9 i może mieć długość do 50 kb. To DNA jest gotowe do dalszych zastosowań, takich jak trawienie endonukleazą restrykcyjną, PCR i Southern blots.

Dostarczone odczynniki	Numer katalogowy	NA2100 10 Preps	NA2110 70 Preps	NA2120 350 Preps
Roztwór do lizy bakterii Gram-dodatnich	L7539	3 mL	20 mL	90 mL
Roztwór do lizy&T	B6678	2.5 mL	20 mL	90 mL
Roztwór do lizy C	B8803	2.5 mL	20 mL	90 mL
Roztwór płuczący 1	W0263	7 mL	50 mL	225 mL
Koncentrat roztworu myjącego	B6553	2.5 mL	20 mL	90 mL
Roztwór rozcieńczający (10 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 9.0)	B6803	5 mL	35 mL	180 mL
Roztwór do przygotowania kolumn	C2112	7 mL	60 mL	225 mL
Proteinaza K	P2308	1 x 5 mg	3 x 10 mg	2 x 100 mg
RNase A Solution	R6148	0.25 mL	1.7 mL	8 mL
Kolumny wiążące kwas nukleinowy GenElute w probówce	C9471	10 sztuk	70 sztuk	5 x 70 sztuk
Kolumny o pojemności 2.0 ml	T5449 lub T7813	3 x 10 sztuk	3 x 70 sztuk	15 x 70 sztuk

Sprzęt i odczynniki wymagane, ale niedostarczane

• Łaźnia wodna 37 °C lub blok grzejny
• Końcówki do pipet (zalecana bariera aerozolowa)
• 1.
• 55 °C łaźnia wodna lub blok grzewczy
• Końcówki do pipet (zalecana bariera aerozolowa)
• 1.5 mL probówka do mikrowirówki do lizy
• Mikrowirówka (2 mL probówka, wyposażona w rotor)*
• Etanol (95%-100%), Nr kat. E7023,  E7148.lub 459836
• Woda odczynnikowa do biologii molekularnej, nr kat. W4502
• Lizozym, Nr kat. L4919  (tylko dla bakterii Gram-dodatnich)
• Mutanolizyna, Nr kat. M9901 (tylko dla gatunków Streptococcus 
• Lizostafina, Nr kat. L7386 (tylko dla Staphylococcus 

Uwaga: Aby zapewnić prawidłowe dopasowanie wszystkich probówek, zaleca się stosowanie 24-miejscowego rotora. Jeśli używasz 36-miejscowego rotora, zalecamy użycie co drugiego miejsca w celu prawidłowego dopasowania probówek.

Przechowywanie i stabilność

Przechowuj zestaw w temperaturze pokojowej. Jeśli jakikolwiek odczynnik zestawu utworzy osad, należy podgrzać go w temperaturze 55-65 °C do momentu rozpuszczenia się osadu i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed użyciem.

Instrukcje przygotowania

1. Podgrzać łaźnię wodną lub blok grzejny do temperatury 55 °C
   Do stosowania zarówno z bakteriami Gram-dodatnimi, jak i Gram-ujemnymi.  
   
2. Podgrzej łaźnię wodną lub blok grzejny do 37 °C
   Do użytku tylko z bakteriami Gram-dodatnimi.
    
3. Dokładnie wymieszać odczynniki
   Sprawdzić odczynniki pod kątem wytrącania się osadu. Jeśli jakikolwiek odczynnik utworzy osad, podgrzej go w temperaturze 55-65°C, aż osad się rozpuści, a następnie schłódź do temperatury pokojowej przed użyciem.
    
   
4. Rozcieńczyć koncentrat roztworu płuczącego
   Rozcieńczyć koncentrat za pomocą 10 ml (10 pakietów przygotowawczych), 80 ml (70 pakietów przygotowawczych) lub 360 ml (350 pakietów przygotowawczych) 95-100% etanolu. Po każdym użyciu szczelnie zakręć rozcieńczony roztwór do płukania, aby zapobiec odparowaniu etanolu.
    
5. Rekonstytucja Proteinazy K
   Rozpuść proszek w jednej butelce Proteinazy K w wodzie, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 20 mg/ml, zgodnie z Tabelą 1. Roztwór Proteinazy K może być przechowywany przez kilka dni w temperaturze 2-8 °C. W celu dłuższego przechowywania niewykorzystaną część roztworu można przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebna. Dostarczony produkt jest stabilny w temperaturze pokojowej.
   
   Uwaga: Roztwór proteinazy K należy za każdym razem dodawać bezpośrednio do każdej próbki. Nie należy łączyć roztworu proteinazy K i roztworu do lizy w celu przechowywania.

Tabela 1 Przygotowanie roztworu proteinazy K

Numer katalogowy	Proteinaza K	Woda
NA2100	5 mg	0.25 ml
NA2110	10 mg	0.5 mL
NA2120	100 mg	5.0 mL

6.  Przygotuj roztwór lizozymu (tylko dla bakterii Gram-dodatnich)
   Przygotuj roztwór podstawowy lizozymu o stężeniu 2.115 × 106 jednostek/ml roztworu podstawowego lizozymu (L4919) (około 45 mg/ml) przy użyciu dołączonego roztworu do lizy bakterii Gram-dodatnich (L7539) jako rozcieńczalnika. Na przykład, aby przygotować 1 ml roztworu lizozymu, należy rozpuścić 2,115 × 106 jednostek lizozymu w 1 ml roztworu lizującego Gram-dodatniego.
   
   Mieszaninę należy rozprowadzić pipetą w górę i w dół lub worteksować w celu rozpuszczenia lizozymu (patrz uwaga poniżej). Dla każdego preparatu DNA wymagane jest 200 μL roztworu lizozymu. Przygotuj dodatkowy roztwór, aby uwzględnić błąd pipetowania.  Roztwór lizozymu powinien być użyty w dniu przygotowania.
   
   Uwaga: Lizozym może łatwiej rozpuszczać się przez pipetowanie mieszaniny w górę i w dół, w przeciwieństwie do worteksowania. Nadmierne wirowanie może spowodować pienienie. Lizozym może nie rozpuszczać się łatwo, w którym to przypadku nie musi być całkowicie rozpuszczony przed użyciem. Wydajność genomowego DNA nie ulegnie zmianie, ponieważ lizozym rozpuści się podczas inkubacji w temperaturze 37°C.

 

Procedura

Jeśli minimalnie ścinane genomowe DNA jest pożądane w dalszych zastosowaniach, np, w przypadku użycia produktu końcowego do długiej amplifikacji PCR, wymieszać za pomocą delikatnego pipetowania lub odwracania do uzyskania jednorodności zamiast worteksowania w poniższej procedurze. Patrz Załącznik 1, aby przeliczyć siłę g na RPM.

A. Przygotowanie bakterii Gram-ujemnych

1a. Zebrać komórki
Odwirować 1,5 ml całonocnej bulionowej hodowli bakteryjnej przez 2 minuty z prędkością 12 000-16 000 × g. Uwaga: Jeśli bakterie są rozmnażane w bogatych pożywkach, takich jak bulion Terrific (T9179), konieczne będzie zmniejszenie objętości materiału wyjściowego do 0,5 ml.5 ml całonocnej kultury bulionu bakteryjnego, aby uniknąć przeciążenia kolumn GenElute™. Więcej informacji znajduje się w Załączniku 2.

2a. Ponownie zawiesić komórki
Dokładnie zawiesić osad w 180 μl Roztworu do Lizy T/Buforu STL do GenElute™ Mammalian Genomic DNA Kit (B6678). Jeśli pozostałości RNA nie stanowią problemu, należy przejść do kroku 3a.
Opcjonalna obróbka RNazą A: Jeśli wymagane jest genomowe DNA wolne od RNA, dodaj 20 μL roztworu RNazy A (R6148), wymieszaj i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie kontynuuj krok 3a.

3a. Przygotowanie do lizy komórek
Dodaj 20 μL roztworu proteinazy K do próbki. Wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 55°C.

4a. Liza komórek
Dodaj 200 μL Roztworu do Lizy C (B8803), dokładnie wymieszaj (około 15 sekund) i inkubuj w temperaturze 55 °C przez 10 minut.
Jednorodna mieszanina jest niezbędna do skutecznej lizy.
Kontynuuj krok 5.

B. Przygotowanie bakterii Gram-dodatnich

1b. Przygotuj roztwór lizozymu używając lizozymu z białka jaja kurzego (L4919)
Przygotuj roztwór podstawowy lizozymu o stężeniu 2,115 × 106 jednostek/ml zgodnie z opisem w części Instrukcje przygotowania. Do każdego przygotowania DNA wymagane jest 200 μL roztworu lizozymu. Przygotuj dodatkowy roztwór, aby uwzględnić błąd pipetowania.
Uwaga: Jeśli pracujesz z gatunkami Staphylococcus, uzupełnij roztwór lizozymu 200 jednostkami / ml lizostafiny (L7386). W przypadku gatunków Streptococcus, uzupełnij roztwór lizozymu 250 jednostkami/ml mutanolizyny (M9901).

2b. Zebrać komórki
Odwirować 1,5 ml całonocnej bulionowej hodowli bakteryjnej przez 2 minuty z prędkością 12 000-16 000 × g. Całkowicie usunąć podłoże hodowlane i wyrzucić.
Uwaga: Jeśli bakterie są rozmnażane w bogatych pożywkach, takich jak bulion Terrific (T9179), konieczne będzie zmniejszenie objętości materiału wyjściowego do 0,5 ml całonocnej hodowli bulionu bakteryjnego, aby uniknąć przeciążenia kolumn GenElute™. Więcej informacji znajduje się w Załączniku 2.

 

3b. Ponownie zawiesić komórki
Dokładnie zawiesić osad w 200 μL roztworu lizozymu (przygotowanego w kroku 1b) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
Opcjonalna obróbka RNazą A: Jeśli pozostałości RNA nie stanowią problemu, kontynuować od kroku 4b. Jeśli wymagane jest genomowe DNA wolne od RNA, dodaj 20 μL roztworu RNazy A i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie kontynuuj krok 4b.

4b. Liza komórek
Dodaj 20 μL roztworu Proteinazy K do próbki, a następnie 200 μL Roztworu do Lizy C (B8803). Dokładnie wymieszać (około 15 sekund) i inkubować w temperaturze 55°C przez 10 minut. Jednorodna mieszanina jest niezbędna do skutecznej lizy. Kontynuować krok 5.

Izolacja DNA z bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych
Jest to kontynuacja procedury z lizatów przygotowanych w krokach 1-4a i/lub krokach 1-4b.

5. Przygotowanie kolumny
Dodaj 500 μL roztworu do przygotowania kolumny do każdej wstępnie zmontowanej kolumny wiążącej GenElute™ Miniprep (z czerwonym o-ringiem, nie mylić z innymi zestawami GenElute™) umieszczonej w probówce o pojemności 2 ml. Wirować z prędkością 12 000 × g przez 1 minutę. Wyrzucić eluat.
Uwaga: Roztwór przygotowujący kolumnę maksymalizuje wiązanie DNA z membraną, co skutkuje bardziej spójną wydajnością.

6. Przygotuj do wiązania
Dodaj 200 μL etanolu (95-100%) do lizatu i dokładnie wymieszaj przez worteksowanie przez 5-10 sekund. Niezbędne jest uzyskanie jednorodnej mieszaniny.

7. Załaduj lizat
Przenieś całą zawartość probówki do kolumny wiążącej. Użyj szerokiego otworu końcówki pipety, aby zmniejszyć ścinanie DNA podczas przenoszenia zawartości do kolumny. Wirować z prędkością ≥ 6500 × g przez 1 minutę. Wyrzucić probówkę zawierającą eluat i umieścić kolumnę w nowej probówce o pojemności 2 ml.

8. Pierwsze płukanie
Dodaj 500 μL roztworu płuczącego 1 (W0263) do kolumny i wiruj przez 1 minutę z prędkością ≥ 6500 × g. Odrzuć probówkę zawierającą eluat i umieść kolumnę w nowej probówce o pojemności 2 ml.

9. Drugie płukanie (Ważne przypomnienie: Sprawdź, czy etanol został dodany do butelki koncentratu roztworu płuczącego.)
Dodaj 500 μL roztworu płuczącego do kolumny i wiruj przez 3 minuty z maksymalną prędkością (12 000-16 000 × g), aby osuszyć kolumnę. Kolumna musi być wolna od etanolu przed elucją DNA.
Wirować kolumnę przez dodatkową 1 minutę z maksymalną prędkością, jeśli widoczne są pozostałości etanolu. Możesz opróżnić i ponownie użyć probówki zbiorczej, jeśli potrzebujesz tego dodatkowego etapu wirowania. Na koniec wyrzuć probówkę zbierającą zawierającą eluat i umieść kolumnę w nowej probówce zbierającej o pojemności 2 ml.

10. Elucja DNA
Odmierzyć pipetą 200 μL roztworu elucyjnego (B6803) bezpośrednio na środek kolumny; wirować przez 1 minutę z prędkością ≥ 6500 × g w celu elucji DNA. Aby zwiększyć wydajność elucji, należy inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej po dodaniu Roztworu do elucji, a następnie odwirować.
Opcjonalnie: Drugą elucję można zebrać, powtarzając krok 10 z dodatkowymi 200 μL Roztworu do elucji i eluując do nowej probówki zbierającej o pojemności 2 ml lub do tej samej probówki zbierającej o pojemności 2 ml, która została użyta do pierwszego eluatu. Wydajność można poprawić o 20-50% podczas wykonywania drugiej elucji.

Eluat zawiera czyste genomowe DNA. Do krótkotrwałego przechowywania DNA zaleca się temperaturę 2-8°C.
Do długotrwałego przechowywania zaleca się temperaturę -20°C. Należy unikać zamrażania i rozmrażania, które powodują przerwy w nici DNA. Roztwór do elucji pomoże ustabilizować DNA w tych temperaturach.

Rysunek 1. PFGE bakteryjnego gDNA wyizolowanego za pomocą zestawu GenElute™ Bacterial gDNA Kit.

Oczyszczone genomowe DNA zostało wyizolowane z różnych gatunków bakterii przy użyciu zestawu GenElute™ Bacterial Genomic DNA. Podwielokrotność 1 μg DNA z każdej odpowiedniej próbki bakteryjnej została rozdzielona na 1% żelu agarozowym w 0,5X TBE przy 150 woltach przez 16 godzin przy użyciu systemu BioRad CHEF DRII. Początkowy czas impulsu wynosił 2 sekundy, końcowy czas impulsu wynosił 13 sekund, stosunek początkowy wynosił 1,0, prędkość pompy ustawiono na 70, a PFGE przeprowadzono w temperaturze 4 °C. M oznacza marker 0,1-200 kb Pulse (nr kat.  D2291).

Lanes

1. E. coli
2. P. fluorescens
3. B. subtilis

.

Wyniki

Stężenie i jakość genomowego DNA można określić za pomocą analizy spektrofotometrycznej i elektroforezy w żelu agarozowym. Rozcieńczyć DNA w buforze TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0-8,5) i zmierzyć absorbancję przy 260 nm, 280 nm i 320 nm przy użyciu mikrokuwety kwarcowej. Absorbancja przy 260 nm i 280 nm powinna wynosić od 0,1 do 1,0 (lub mieścić się w zakresie liniowym spektrofotometru). Absorbancja 320 nm jest używana do korekty absorbancji tła. Absorbancja 1,0 przy 260 nm odpowiada około 50 μg/ml dwuniciowego DNA. Stosunek A260-A320/A280-A320 powinien wynosić 1,6-1,9.
Rozmiar i jakość DNA można określić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.¹ Żel zawierający 0.8% agarozę (A9539) w 0,5-krotnym buforze TBE (T6400) działa dobrze do rozdzielczości genomowego DNA. DNA może być wizualizowane poprzez barwienie barwnikiem interkalującym, takim jak bromek etydyny (E1510) i mierzone względem znanego markera DNA, takiego jak Lambda DNA Hind III digest (D9780). Genomowe DNA powinno migrować jako pojedyncze pasmo o wysokiej masie cząsteczkowej z bardzo niewielkimi oznakami ścinania. Bardziej precyzyjne określenie rozmiaru DNA można wykonać za pomocą elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym.²

Rozwiązywanie problemów

Problem	Przyczyna	Rozwiązanie
Lizozym jest trudny do rozpuszczenia	Roztwór jest nieodpowiednio wymieszany.	Pipetuj w górę i w dół, aby rozpuścić lizozym, a nie worteksuj. Nadmierne wirowanie spowoduje pienienie i zmniejszy rozpuszczalność lizozymu. Lizozym może nie rozpuszczać się łatwo. Nie musi być całkowicie rozpuszczony przed użyciem, ponieważ rozpuści się podczas inkubacji w 37 °C.
Kolumna wiążąca jest zatkana	Próbka jest zbyt duża.	W przyszłości użyj mniejszej liczby komórek (≥ 1 × 1010 komórek/ml). Aby uratować obecny preparat, zwiększ siłę g i/lub wiruj dłużej, aż lizat przejdzie przez kolumnę wiążącą. Wydajność genomowego DNA może być zmniejszona.
Lizat wydaje się być bardzo galaretowaty przed załadowaniem na kolumnę.	Próbka jest zbyt duża.	W przyszłości użyj mniejszej liczby komórek (≥ 1 × 1010 komórek/ml). Wydłuż czas inkubacji i/lub zwiększ ilość roztworu proteinazy K (krok 3a) lub roztworu lizozymu (krok 3b), w zależności od tego, czy wykonywana jest procedura Gram-ujemna czy Gram-dodatnia. Na przykład, należy podwoić czas inkubacji, jak również ilość enzymu.
Wydajność genomowego DNA jest niska.	Próbka jest stara.	Wydajność będzie różna dla różnych gatunków i szczepów bakterii. Może być konieczne użycie kultur bakteryjnych zanim osiągną maksymalną gęstość lub gdy staną się w pełni konfluentne.
	Komórki są niewystarczająco lizowane.	Wydłuż czas inkubacji i/lub zwiększ ilość roztworu proteinazy K (krok A3) lub roztworu lizozymu (krok B3), w zależności od tego, czy wykonywana jest procedura dla bakterii Gram-ujemnych czy Gram-dodatnich. Na przykład, należy podwoić czas inkubacji, jak również ilość enzymu.
	Mieszanina lizatu/etanolu nie jest jednorodna.	Aby zapewnić jednorodny roztwór, należy worteksować 5-10 sekund przed nałożeniem na kolumnę wiążącą. Jeśli minimalnie ścięte genomowe DNA jest pożądane w dalszych zastosowaniach, np, jeśli produkt końcowy jest używany do długiej amplifikacji PCR, wymieszaj za pomocą delikatnego pipetowania lub odwracania do uzyskania jednorodności zamiast worteksowania.
	Elucja DNA jest niekompletna.	Sprawdź, czy DNA zostało eluowane w 200 μL roztworu elucyjnego. Wydajność DNA można poprawić przez inkubację roztworu elucyjnego przez 5 minut w temperaturze pokojowej po dodaniu go do kolumny. Można przeprowadzić drugą i trzecią elucję przy użyciu 200 μL roztworu elucyjnego.
	Etanol został pominięty podczas wiązania.	Sprawdź, czy etanol został dodany w kroku 6 przed nałożeniem próbki na kolumnę wiążącą w kroku 7.
	Eluat zawiera pozostałości etanolu z płukania.	Etanol z końcowego płukania musi zostać usunięty przed elucją DNA. Wiruj dłużej lub drugi raz, aby wysuszyć membranę. Jeśli eluat zawierający etanol styka się z kolumną wiążącą, powtórz etap wirowania przed elucją DNA.
	Koncentrat roztworu płuczącego nie został rozcieńczony przed użyciem.	Sprawdź, czy koncentrat roztworu płuczącego został prawidłowo rozcieńczony etanolem przed użyciem.
	Woda została użyta do elucji zamiast Roztworu Elucyjnego.	Roztwór Elucyjny jest zalecany dla optymalnej wydajności i przechowywania oczyszczonego DNA. Jeśli do elucji DNA używana jest woda, należy upewnić się, że pH wynosi co najmniej 7,0, aby uniknąć kwaśnych warunków, które mogą narażać DNA na hydrolizę kwasową podczas przechowywania przez długi czas.
Czystość DNA jest niższa niż oczekiwano; stosunek A260/A280 jest zbyt niski.	Próbka została rozcieńczona w wodzie.	Użyj roztworu elucyjnego (10 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0) lub 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-8,5 jako eluentu.
	Odczyt tła jest wysoki ze względu na drobiny krzemionki.	Wiruj próbkę DNA z maksymalną prędkością przez 1 minutę; użyj supernatantu do powtórzenia odczytów absorbancji.
Czystość DNA jest niższa niż oczekiwana; stosunek A260/A280 jest zbyt wysoki.	Genomowe DNA jest zanieczyszczone RNA.	W przyszłych izolacjach należy uwzględnić etap traktowania RNazą A lub potraktować produkt końcowy Roztworem RNazy A i ponownie oczyścić. Może być konieczne wydłużenie czasu inkubacji RNazy A w krokach A2 i B3 w celu całkowitego strawienia pozostałości RNA.
DNA jest ścinane.	Z genomowym DNA obchodzono się nieprawidłowo.	Ten zestaw został zaprojektowany w celu wyeliminowania wytrącania i ponownego zawieszania DNA, powszechnych kroków występujących w innych zestawach genomowego DNA, które mogą prowadzić do ścinania. Wszystkie etapy pipetowania powinny być wykonywane tak delikatnie, jak to możliwe. Zaleca się stosowanie końcówek do pipet z szerokim otworem, aby wyeliminować ścinanie. Jeśli minimalnie ścinane genomowe DNA jest pożądane w dalszych zastosowaniach, np, jeśli produkt końcowy jest używany do długiej amplifikacji PCR, wymieszaj go delikatnym pipetowaniem lub odwracaniem do uzyskania jednorodności zamiast worteksowania.
	Komórki są stare.	Kultury hodowane przez dłuższy czas mogą ulec przedwczesnej lizie po wystawieniu na działanie enzymów lizujących ścianę komórkową, co skutkuje uwolnieniem endogennych nukleaz i późniejszą degradacją DNA. Rozpocznij od świeżych hodowli. Dalsze zastosowania są zahamowane.
	Etanol jest przenoszony na końcowy preparat genomowego DNA.	Po końcowym płukaniu kolumny wiążącej (krok 9), nie pozwól, aby eluat zetknął się z kolumną. Ponownie wiruj kolumnę, jeśli to konieczne, po opróżnieniu probówki zbierającej, przez dodatkową 1 minutę z maksymalną prędkością (12 000-16 000 × g).
	Sól jest przenoszona do końcowego preparatu genomowego DNA.	Upewnij się, że kolumna wiążąca została przeniesiona do nowej probówki o pojemności 2 ml przed dodaniem roztworów płuczących w krokach 8 i 9.

Załącznik 1

Uwaga: Wszystkie prędkości wirowania podano w jednostkach g. Informacje na temat przeliczania siły g na liczbę obrotów na minutę można znaleźć w tabeli 2. Jeśli wirówki/wirniki o wymaganej sile g nie są dostępne, należy użyć maksymalnej możliwej siły g i proporcjonalnie wydłużyć czas wirowania. Wirować, aż cała ciecz przejdzie przez kolumnę.

Tabela 2. Konwersja siły odśrodkowej (w jednostkach g) na obroty na minutę dla zwykłych wirników

Wirówka	Silnik	Rurki (maks.)	Promień (cm)	obr.Promień (cm)	obr/min przy 6 500 x g	obr/min przy 12 000 x g	rpm at 16,000 x g
Eppendorf 5410	-	12	5.8	10,012	13,555	15,652
5415C	F45-18-11	18	7.3	8,924	12,124	14,000
5415D&R	F45-24-11	24	8.3	8,369	11,392	13,155
5417C,D,&R	F45-30-11	30	9.5	7,823	10,634	12,279

Powyższa tabela zawiera prędkości wirowania w RPM dla wybranych popularnych wirówek i rotorów. Prawidłową prędkość obrotową dla niewymienionych rotorów można obliczyć za pomocą wzoru:

gdzie RCF = wymagane przyspieszenie grawitacyjne (względna siła odśrodkowa) w jednostkach g;
r = promień wirnika w cm;
RPM = liczba obrotów na minutę wymagana do osiągnięcia wymaganej siły g

Załącznik 2  

.

Tabela 3. Typowa wydajność DNA przy użyciu zestawu GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit

Źródło	Rodzaj podłoża	Ilość hodowli całonocnej	OD600 na mL hodowli całonocnej*	Typowa wydajność DNA (z traktowaniem RNazą)**
Escherichia coli, ATCC# 11775	Terrific broth (T9179)	0.8 ml	12.5	20 μg
Escherichia coli, ATCC# 11775	Terrific broth (L7658)	1.5 ml	5	20 μg
Escherichia coli DH10B	Terrific broth (L7658)	1.0 mL	5	15 μg
Pseudomonas fluorescens, ATCC# 13525	Terrific broth (T9179)	0.8 mL	16	25 μg
Pseudomonas fluorescens, ATCC# 13525	Terrific broth (N7519)	1.5 mL	2	20 μg
Bacillus subtilis, ATCC# 6051	Terrific broth (T1438)	1.5 ml	6	25 μg
Streptococcus mutans, ATCC# 35668	Terrific broth (T1438)	1.5 ml	1.3	15 μg***
Streptococcus mutans, ATCC# 14990	Terrific broth  (N7519)	1.5 ml	2	8 μg****
* Wartości skorygowane o współczynnik rozcieńczenia. Wszystkie odczyty uzyskano przy użyciu spektrofotometru Varian Cary® 100. ** Na podstawie wykonania dwóch elucji 200 μL. *** Roztwór lizozymu uzupełniono 250 jednostkami/ml mutanolizyny (M9901). **** Roztwór lizozymu uzupełniono 200 jednostkami/ml lizostafiny (L7386).

Środki ostrożności i zastrzeżenia

Zestaw GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit jest przeznaczony wyłącznie do użytku badawczo-rozwojowego, a nie do celów farmaceutycznych, domowych lub innych. Należy zapoznać się z Kartą Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (SDS) w celu uzyskania informacji dotyczących zagrożeń i bezpiecznego postępowania.

GenElute jest znakiem towarowym firmy Sigma-Aldrich Co. LLC.

Referencje

1. Sambrook, JF, Russell, D. ( 2001).. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed.. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY:

2. BIRREN B, LAI E. 1993. FIELD INVERSION GEL ELECTROPHORESIS.121-128. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-101290-8.50011-0