Tworzenie organotypowych kultur skóry 3D z interfejsem powietrze-ciecz (ALI) jako modelu in vitro ludzkiego naskórka

• Organotypowe produkty do hodowli komórek skóry 3D
• Protokół dla organotypowych hodowli komórek skóry 3D z wykorzystaniem interfejsu powietrze-ciecz (ALI)
• Tips and Tricks for Generating Organotypic Skin Cultures
• Organotypowe modele skóry

Skóra jest największym organem w ludzkim ciele i pełni wiele funkcji, w tym ochronę, wchłanianie substancji i termoregulację. Skóra ma złożoną strukturę warstwową składającą się z trzech głównych warstw: 1) ciasno upakowane komórki naskórka tworzą barierę przed intruzami i utratą wody oraz obejmują zewnętrzną warstwę zwaną warstwą rogową naskórka, składającą się z nakładających się, nieżywotnych korneocytów, które chronią przed zagrożeniami, takimi jak promieniowanie UV i patogeny; 2) skóra właściwa, która wspiera naskórek i zawiera zakończenia nerwowe, gruczoły potowe, gruczoły łojowe, mieszki włosowe i naczynia krwionośne. Warstwa podstawna skóry właściwej to miejsce, w którym keratynocyty nieustannie przechodzą mitozę w celu uzupełnienia komórek; oraz 3) warstwa podskórna lub podskórna, która zawiera głównie adipocyty i działa w celu ochrony leżących poniżej tkanek, jako rezerwa energii i zapewnienia pewnej termoregulacji poprzez izolację.

W przeszłości modele zwierzęce były wykorzystywane do badania toksyczności i skuteczności kosmetyków¹ oraz przezskórnego wchłaniania leków.² Jednak ze względu na obawy etyczne, te modele zwierzęce zostały stopniowo zastąpione przez "wolne od okrucieństwa" in vitro modele organotypowe./i> organotypowymi modelami skóry, które wykorzystują pierwotne ludzkie komórki i wkładki do hodowli komórkowych w celu odtworzenia warstwowej architektury naskórka.³  W 2013 roku Unia Europejska jako pierwsza całkowicie zakazała testowania kosmetyków na zwierzętach (Cruelty Free International). Opisujemy tutaj krok po kroku protokół hodowli, który można wykorzystać do generowania modeli ludzkiego naskórka przy użyciu pierwotnych ludzkich keratynocytów (PHK), fibroblastów skórnych (pierwotne ludzkie fibroblasty, PHF), pokrytych kolagenem komórek Millicell^® wkładki do hodowli komórkowych i opatentowane 3dGRO™ Skin Differentiation Medium które wspiera silne różnicowanie keratynocytów podczas etapów hodowli w powietrzu:ciecz.

Rysunek 1. Przegląd protokołu organotypowej hodowli ludzkiej skóry. Przygotować podłoże kolagenowo-fibroblastyczne (PHF) we wkładkach Millicell^®. Posiać i hodować keratynocyty (PHK) na podłożu przez trzy dni. Podnieś wkładkę do interfejsu powietrze:ciecz, aby wywołać różnicowanie skóry. Zmieniaj pożywkę do hodowli skóry co drugi dzień i zbierz hodowlę w dniu 10.

Protokół do hodowli komórek skóry 3D w organotypowym interfejsie powietrze-ciecz (ALI)

Uwaga: Jakość pierwotnych ludzkich keratynocytów (PHK) i fibroblastów (PHF) ma kluczowe znaczenie dla generowania wysokiej jakości hodowli skóry 3D. Należy używać wyłącznie komórek pierwotnych, które znajdują się w przejściu 1 lub 2 i nie dopuszczać do nadmiernego zagęszczenia komórek.

1. Odmroź jedną fiolkę pierwotnych ludzkich keratynocytów (C-12001, C-12005, 102-05N) i ludzkich fibroblastów skórnych (C-12300, 106-05N) lub komórki NIH 3T3 (93061524) w odpowiednich pożywkach wzrostowych (C-20111, C-12300, ).nbsp;131-500, C-23110, 116-500).Odświeżaj hodowlę świeżym podłożem co drugi dzień, aż osiągnie ona 80-90% konfluencji.
2. Przygotuj podłoża kolagenowe/PHF (przygotuj na lodzie) (8 mL całkowitej objętości)
   1. Dodaj 6 mL kolagenu z ogona szczura (08-115) do stożkowej probówki o pojemności 15 mL (patrz arkusz danych specyficzny dla partii).
   2. Dodaj 1,6 ml 5-krotnego buforu rekonstytucyjnego (1,1% NaHCO₃, 0,025N NaOH, 100 mM HEPES, 5X DMEM/F12). Dobrze wymieszać. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza do kolagenu.
   3. Dodaj 400 µl PHF (4x10⁶ komórek/mL zawiesiny komórek) lub komórek NIH 3T3. Dokładnie wymieszaj, ale unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza do kolagenu. Przechowywać na lodzie.
   4. Nanieś 400 µl mieszaniny kolagenu i PHF bezpośrednio na środek każdego wkładu Millicell^® (PTHT12H48). Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas alikwotowania. Inkubować wkładki/płytki w temperaturze 37°C przez co najmniej 30 minut, aby umożliwić całkowitą polimeryzację. Po zżelowaniu, płytki kolagenowe/PHF pozostają użyteczne do pięciu godzin bez dodawania pożywki, gdy są utrzymywane w temperaturze 37 °C.
3. Dodaj 0,5 ml PHK (4x10⁵ komórek/mL zawiesiny komórkowej) do każdej płytki kolagenowej/PHF. Należy uważać, aby nie uszkodzić podłoża kolagenowego/PHF, ponieważ może to spowodować wyciek lub skurcz. Dodaj 2 ml pożywki dla keratynocytów na zewnątrz wkładek w zwykłej płytce 12-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37°C przez noc. Następnego dnia, bez usuwania oryginalnej pożywki, dodaj dodatkowe 0,5 ml pożywki dla keratynocytów do wnętrza każdej płytki i inkubuj w temperaturze 37°C przez kolejne 2 dni. PHK powinny znajdować się w hodowli zanurzonej na podłożach kolagenowych przez łącznie trzy dni. Wysokiej jakości PHK osiągną 100% konfluencji w trzecim dniu hodowli zanurzonej.
4. W czwartym dniu delikatnie odessać pożywkę z każdej płytki. Nie dotykaj ani nie uszkadzaj powierzchni podłoża kolagenowego. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś wkładki do głębokiej 12-dołkowej płytki (Greiner Bio-One 665110) zawierającej 4,5 ml 3dGRO™ Skin Differentiation Medium (SCM310) w każdej studzience.
   Uwaga:  Musisz dodać dokładną ilość pożywki na zewnątrz wkładek, aby umożliwić utrzymanie kultur skóry na granicy faz powietrze:ciecz. Jeśli na zewnątrz wkładki zostanie dodana zbyt duża ilość pożywki, może to wymusić przedostanie się dodatkowej pożywki do wkładki i nasączenie powierzchni skóry, co spowoduje zakłócenie różnicowania.
5. Inkubuj hodowlę skóry w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 10 dni. Podczas 10-dniowej inkubacji wymieniaj pożywkę 3dGRO™ Skin Differentiation Medium co drugi dzień i usuwaj wszelkie pęcherzyki powietrza spod membrany wkładki. Po 10 dniach hodowli 3D skóry powinno powstać około 8 do 10 warstw żywego nabłonka.

Porady i wskazówki dotyczące tworzenia organotypowych kultur skóry

• Kolagen jest bardzo lepki i szybko się zestala. Złoże kolagenu może nie rozprzestrzeniać się równomiernie na powierzchni wkładki, jeśli końcówka pipety dotknie ścianki wkładki podczas dodawania mieszaniny kolagenu i komórek. Nierównomiernie rozłożony kolagen może słabo przylegać do ścianki płytki, powodując kurczenie się kolagenu i umożliwiając przedostanie się pożywki do dołka. Lepszym sposobem ułożenia kolagenu jest dodanie mieszaniny do środka płytki, upewniając się, że końcówka nie dotyka membrany.
• Aby dokonać miniaturyzacji z formatu 12-dołkowego do 24-dołkowego, należy zoptymalizować następujące parametry:
  • Gęstość wysiewu komórek
  • Objętość kolagenu pokrytego powłoką
  • Ilość podstawowego podłoża bocznego
• Zoptymalizowany protokół hodowli komórek skóry ALI przy użyciu trzech różnych Millicell^® w formacie 24-dołkowym, w połączeniu z 24-dołkową płytką Falcon^® (CLS353047):
  1. Dodaj keratynocyty do świeżo przygotowanego podłoża kolagenowego NIH 3T3:
     • Wkładka wisząca Millicell z 0.4 μm PET (PTHT24H48)
       • 120 µL komórek 2x10⁵/mL podłoża kolagenowego NIH 3T3
       • 150 µL komórek 2x10⁵/mL podłoża kolagenowego NIH 3T3
       • 150 µL komórek 2x10⁵/mL podłoża kolagenowego NIH 3T3.L komórek 4x10⁵/mL keratynocytów
       • 600 µL pożywki dodanej do strony podstawowej
     • Wkładki stojące Millicell z 0.4 μm hydrofilowego PTFE (PICM01250) lub poliwęglanu (PIHP01250)
       • Pokryć membranę 100 μL mieszanki kolagenu i etanolu, zgodnie z Protokoły powlekania ECM dla wkładek i płytek Millicell^®
       • 240 µl 0.48x10⁵ komórek/mL podłoża kolagenowego NIH 3T3
       • 300 µL 0.12x10⁵ komórek/mL keratynocytów
       • 600 µL pożywki dodanej do strony bazolateralnej
  2. Zmieniaj pożywkę codziennie

Organotypowe modele skóry

A. Barwienie H&E hodowli organotypowej skóry in vitro

B. Barwienie H&E tkanek skóry noworodków Ex-Vivo

C. Barwienie filagryną hodowli organotypowej skóry in vitro

D. Barwienie filagryną tkanek skóry noworodków Ex-Vivo

Ryc. 2. Organotypowe modele skóry mają morfologię nabłonka warstwowego porównywalną do tkanki skóry noworodków.Barwienie H&E hodowli skóry in vitro i skrawków skóry ex vivo zawierających zarówno warstwę skórną, jak i naskórkową (A, B). Barwienie filagryną identyfikuje zrogowaciałe warstwy keratynocytów (brązowe) (C, D).

A. Barwnik Ki-67

B. Barwienie H&E

C. Plama Filaggrina

Rysunek 3. Organotypowe modele skóry wyhodowane na pokrytych kolagenem wkładkach Millicell^® z hydrofilową membraną PTFE 0.4 µm hydrofilową membraną PTFE (PICM01250) zawierają aktywnie proliferujące keratynocyty. Modele skóry In vitro wybarwione przeciwciałem anty-Ki-67 (275R-1) (brązowe) (A), H&E (B) i przeciwciałem anty-filaggrin (HPA030189) (brązowy) (C) identyfikują komórki różnicujące się i proliferujące w warstwie podstawnej skóry właściwej.

Referencje

1. Adler S, Basketter D, Creton S, Pelkonen O, van Benthem J, Zuang V, Andersen KE, Angers-Loustau A, Aptula A, Bal-Price A, et al. 2011. Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects?2010. Arch Toxicol. 85(5):367-485. https://doi.org/10.1007/s00204-011-0693-2

2. Abd E, Yousuf S, Pastore M, Telaprolu K, Mohammed Y, Namjoshi S, Grice J, Roberts M. Skin models for the testing of transdermal drugs. CPAA. Volume 8163-176. https://doi.org/10.2147/cpaa.s64788

3. Vörsmann H, Groeber F, Walles H, Busch S, Beissert S, Walczak H, Kulms D. 2013. Development of a human three-dimensional organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing. Cell Death Dis. 4(7):e719-e719. https://doi.org/10.1038/cddis.2013.249

4. Wang H, Broker TR, Chow LT. 2015. Robust HPV-18 Production in Organotypic Cultures of Primary Human Keratinocytes.93-109. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2013-6_7

5. Wilson J. 1992. Epithelial-specific gene expression during differentiation of stratified primary human keratinocyte cultures. Cell Growth Differ. 3(8):471-483.