Generowanie organoidów i badania fenotypowe na płytkach mikrostudzienek Millicell^®

Org/PL/plany są cor/PL/plaz powszechniejszym n/PL/plarzędziem wykorzystyw/PL/planym w b/PL/plad/PL/plani/PL/plach biomedycznych i st/PL/planowią trójwymi/PL/plarowe, zmini/PL/platuryzow/PL/plane modele n/PL/plarządów, które możn/PL/pla odtworzyć in vitro. Org/PL/planoidy są obiecującymi model/PL/plami do z/PL/plastosow/PL/plań t/PL/plakich j/PL/plak b/PL/plad/PL/plani/PL/pla n/PL/plad r/PL/plakiem, rozwój chemioter/PL/plapii i rozwój medycyny sperson/PL/plalizow/PL/planej.

Tr/PL/pladycyjne org/PL/planoidy są hodow/PL/plane w zest/PL/plalonej m/PL/placierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), któr/PL/pla często nie jest odtw/PL/plarz/PL/plaln/PL/pla. Utworzone org/PL/planoidy mogą mieć niejednorodne rozmi/PL/plary i kszt/PL/plałty or/PL/plaz mogą być losowo umieszcz/PL/plane w wielu pozycj/PL/plach i ognisk/PL/plach w hydrożelu. Płytki 96-dołkowe Millicell^® Microwell st/PL/pland/PL/plaryzują i pokonują niektóre z wyzw/PL/plań występujących w tr/PL/pladycyjnej hodowli org/PL/planoidów.

• Millicell^® Microwell 96-well Pl/PL/plate Attributes
• Rozwój i ch/PL/plar/PL/plakterystyk/PL/pla org/PL/planoidów jelitowych myszy n/PL/pla płytk/PL/plach mikrostudzienkowych Millicell^®
• CRC Org/PL/planoid Phenotypic Screen on Millicell^® Microwell Pl/PL/plates
• Pogłębion/PL/pla /PL/plan/PL/plaliz/PL/pla /PL/plafuresertibu n/PL/pla org/PL/planoid/PL/plach CRC
• Podsumow/PL/planie b/PL/plad/PL/plani/PL/pla fenotypowego org/PL/planoidów CRC

Rysunek 1. Tradycyjna hodowla organoidów (po lewej) vs hodowla organoidów w 96-dołkowych płytkach Millicell^® Microwell (po prawej).

Atrybuty płytek 96-dołkowych Millicell^® Microwell

Płytki Millicell^® Microwell to gotowa do użycia platforma do wysokowydajnej, skalowalnej i niezawodnej hodowli organoidów. Płytki te zawierają nieprzylegające mikrostudzienki w studzienkach, zwiększając jednorodną wydajność organoidów. Płytki Millicell^® Microwell wymagają niewielkiej ilości lub braku zewnętrznego stałego ECM, każda mikrostudzienka zawiera unikalny hydrożel na bazie glikolu polietylenowego (PEG). Hydrożel PEG pozwala na posiew komórek w dołku i rozwój testów oraz mniejszą dyfrakcję podczas obrazowania w płytce.

Rysunek 2. Schematyczne przedstawienie metod badań przesiewowych organoidów 3D in vitro. Od lewej do prawej, Matrigel^®, powierzchnia nieprzylegająca i płytki Microwell Millicell^®.

Nasze standardowe projekty dla różnych rozmiarów mikrostudzienek pozwalają na skalowanie wytwarzania organoidów przy użyciu 96-studzienkowych płytek Millicell^® Microwell.

*Wskazuje maksymalną możliwą liczbę mikrodołków na studzienkę. Dokładna liczba może się nieznacznie różnić w zależności od studzienki i może różnić się o 7% mniej.

Rozmiary mikrostudzienek (μm)	Liczba mikrostudzienek/studzienkę	Objętość robocza (l)	Dno	Numer produktu
400μm	121*	200	Plastik	MC96U4005
600μm	55*	200	Plastik	MC96U6005

Rysunek 3. Schematyczne przedstawienie mikrostudzienek/dołka dla każdego rozmiaru mikrostudzienki.

Rozwój i charakterystyka mysich organoidów jelitowych na płytkach Millicell^® Microwell

Jedne z pierwszych organoidów, które zostały opisane, mysie organoidy jelitowe są powszechnie stosowanymi modelami dla naukowców badających terapie przeciwnowotworowe, immunologię i mikrobiomikę.Do opracowania i scharakteryzowania mysich organoidów jelitowych wykorzystaliśmy 96-dołkowe płytki Microwell 400μm firmy Millicell^®.

Organy były monitorowane przez cały czas wysiewu, wzrostu i obrazowania; 121 pojedynczych organoidów zostało opracowanych w czasie w jednej studzience. Stwierdzono, że mają one jednorodny rozmiar i są ograniczone do mikrostudzienek, co ułatwia obrazowanie. Organoidy jelitowe myszy wykazywały typową morfologię pączkowania po różnicowaniu, a zróżnicowane komórki jelitowe wyrażały specyficzne markery jelitowe.

Rysunek 4. Organoidy jelitowe myszy hodowane na płytkach Millicell® Microwell. A) 1 godzina, B) 10 godzin, C) 2 godziny, D) 3 dni i E) 4 dni po wysianiu.

Obszar organoidów został określony ilościowo poprzez obrazowanie w czasie w 96-dołkowych płytkach Millicell^® Microwell. Organoidy były ograniczone do określonej mikrownęki i miały jednorodny rozmiar w pierwszych dniach 1-3 wzrostu, a następnie poszerzały się, gdy organoidy zaczęły pączkować.

Rysunek 5. Reprezentatywne przykłady mysich organoidów jelitowych hodowanych na płytkach Millicell^® Microwell w dniach A) 3; B) 5; i C) 8.

Organoidy wykazywały fenotyp pączkowania typowy dla tych organoidów jelitowych i zawierały zróżnicowane komórki, w tym enteroendokrynne, eterocyty, komórki Panetha i komórki kubkowe. Specyficzne markery i polaryzację nabłonka monitorowano za pomocą immunofluorescencji na szklanych szkiełkach obrazowych (rysunek 6).

Rysunek 6. Ekspresja białka mucyny-2 podkreślająca obecność komórek kubkowych w organoidach hodowanych w testach mikrostudzienkowych.

Tworzenie organoidów przy użyciu płytek Millicell^® Microwell jest skalowalne i generuje organoidy o podobnym rozmiarze i kształcie.

CRC Organoid Phenotypic Screen on Millicell^® Microwell plates

.Przeprowadziliśmy zautomatyzowane badanie przesiewowe 80 związków przeciwnowotworowych na sferoidach HCT-116 i organoidach raka jelita grubego (CRC) pochodzących od pacjentów przy użyciu 96-dołkowych płytek Millicell^® Microwell. Odpowiedź jednorodnych mikrotkanek na leczenie była dostępna za pomocą ekranów fenotypowych o wysokiej zawartości obrazowania i wyodrębniono ponad 250 wskaźników fenotypowych. 

Podczas analizy fenotypów organoidów hodowanych na 96-dołkowych płytkach Millicell^® Microwell, podczas podawania afuresertibu ujawniono wcześniej nieobserwowany fenotyp. Pokazujemy tutaj, że 96-dołkowe płytki Millicell^® Microwell mogą być wykorzystywane do oceny działania leków i innych związków na poziomie pojedynczego organoidu w całkowicie zautomatyzowanym, wysokoprzepustowym badaniu przesiewowym.

Rysunek 6. Przebieg badań przesiewowych organoidów CRC. A) Protokół badania przesiewowego organoidów CRC i sferoidów HCT-116 na 96-dołkowych płytkach Millicell^® Microwell, B) Schemat automatycznego (równowaga hydrożelu, siew komórek, zmiany pożywki i ekspozycja na leki oraz analiza) vs. ręcznego (dysocjacja organoidów) generowania organoidów, C) Kwantyfikacja odsetka studzienek, które zawierały kolonię w ręcznym i automatycznym generowaniu organoidów.

Oceniono żywotność organoidów po ekspozycji na związek, a ich fenotyp monitorowano za pomocą analizy obrazowania o wysokiej zawartości. Wyodrębniono ponad 250 metryk z każdego z 40 organoidów, które zostały podzielone na segmenty na studzienkę, a skuteczność leków określono za pomocą kontroli pozytywnych i negatywnych. Badanie wykazało wysoką powtarzalność, z wartością R² wynoszącą 0,9 dla sferoidów i 0,79 dla organoidów.

Dogłębna analiza afuresertibu na organoidach CRC

Afuresertib jest inhibitorem serynowo-treoninowej kinazy białkowej Akt (kinazy białkowej B). Może hamować proliferację komórek nowotworowych i indukować apoptozę komórek nowotworowych poprzez hamowanie Akt. Analiza 80 związków zastosowanych w tym badaniu wykazała, że ekspozycja na afuresertib prowadziła do silnych fenotypów w stężeniach subtoksycznych, w tym do znacznego obrzęku organoidów CRC, a nie sferoidów HCT-116. Jest to fenotyp, który nie jest często monitorowany w klasycznych analizach żywotności, ale można go łatwo zaobserwować przy użyciu 96-dołkowych płytek Millicell^® Microwell.

Rysunek 7. Ekran organoidów CRC z afuresertibem. A) Obrazy szerokokątne i fluorescencyjne przedstawiające rozmiar organoidu w różnych stężeniach afuresertibu, B) Odpowiedź fenotypowa organoidów na rosnące stężenia afuresertibu według obszaru mikrotkanki IC50=0.31μM, C) Żywotność organoidów przy wzrastających stężeniach afuresertibu IC50=10.67μM. Kwas gamboginowy: GA.

CRC Organoid Phenotypic Screen Summary

Tworzenie organoidów CRC i sferoidów HCT-116 w płytkach Millicell^® Microwell, od wysiewu do odczytów obrazowania, było kompatybilne z automatycznymi systemami obsługi cieczy i aplikacjami do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Płytki Millicell^® Microwell pozwoliły również na analizę pojedynczych organoidów zamiast odczytów opartych na populacji, nawet przy generowaniu ponad 70 organoidów na studzienkę. Ten atrybut pomaga badaczom odkrywać fenotypy, które w przeciwnym razie pozostałyby niezauważone.

Organy pochodzące od pacjentów, które zostały wygenerowane na płytkach Millicell^® Microwell, okazały się ściśle modelować odpowiadający im guz i mogą być wykorzystywane przez naukowców do badania specyficznych dla pacjenta odpowiedzi na chemioterapie.

Referencje

1. Lancaster MA, Knoblich JA. 2014. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345(6194): https://doi.org/10.1126/science.1247125

2. Fatehullah A, Tan SH, Barker N. 2016. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nat Cell Biol. 18(3):246-254. https://doi.org/10.1038/ncb3312

3. Schneeberger K, Spee B, Costa P, Sachs N, Clevers H, Malda J. Converging biofabrication and organoid technologies: the next frontier in hepatic and intestinal tissue engineering?. Biofabrication. 9(1):013001. https://doi.org/10.1088/1758-5090/aa6121

4. Sato T, Stange DE, Ferrante M, Vries RG, van Es JH, van den Brink S, van Houdt WJ, Pronk A, van Gorp J, Siersema PD, et al. 2011. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141(5):1762-1772. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2011.07.050