Corning^® Matrigel^® Basement Membrane Matrix do hodowli 3D In Vitro

Matryca błony podstawnej Corning^® Matrigel^® jest rozpuszczalnym ekstraktem błony podstawnej guza myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), który żeluje w temperaturze pokojowej, tworząc prawdziwą odtworzoną błonę podstawną. Głównymi składnikami matrycy Corning Matrigel są laminina (~60%), kolagen IV (~30%), entaktyna (~8%) i proteoglikan siarczanu heparanu. Czynniki wzrostu, kolagenazy, aktywatory plazminogenu i inne niezdefiniowane składniki zostały również zgłoszone w matrycy Corning Matrigel.

Odczynniki i materiały

• Linia komórkowa MDCK
• Matryca Corning Matrigel
Matryca Corning Matrigel
• MEM
• FBS
• PBS
• 0.25% Trypsyna/EDTA
• 24-dołkowa płytka

Protokół 1. Hodowla MDCK 3D

1. Przed użyciem rozmrozić matrycę Matrigel przez noc, zanurzając fiolkę w lodówce w temperaturze 4 °C. Po rozmrożeniu matrycy Matrigel, zawiruj fiolką, aby upewnić się, że materiał jest rozproszony.

2. Dodaj 200 μL matrycy Matrigel (8 do 11 mg/ml) do każdej studzienki wstępnie schłodzonej 24-dołkowej płytki, rozprowadź równomiernie końcówką pipety, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 min.

Uwaga: Wszystkie naczynia hodowlane lub media wchodzące w kontakt z matrycą Matrigel powinny być wstępnie schłodzone/lodowato zimne. Trzymaj matrycę Matrigel na lodzie podczas całego procesu i nie przesuszaj matrycy Matrigel podczas procesu żelowania.

3. Umyj komórki MDCK raz za pomocą PBS. Trypsynizuj komórki, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową, a następnie osusz komórki poprzez wirowanie z prędkością 125 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).

Uwaga: Używaj komórek, które są zdrowe i nie więcej niż 85% konfluentne. Komórki MDCK mają tendencję do tworzenia skupisk komórek; dlatego często konieczne jest ich energiczne pipetowanie w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.

4. Ponownie zawiesić komórki za pomocą kompletnej pożywki MDCK (MEM + 10% FBS), aby dostosować końcową gęstość komórek do 3 x 105 komórek/ml, umieścić 250 μL przygotowanej zawiesiny komórek w każdej studzience wstępnie pokrytej 24-dołkowej płytki, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.

Uwaga: Liczba komórek może wymagać optymalizacji w zależności od właściwości wzrostu linii komórkowej.

5. Schłodzić kompletną pożywkę MDCK na lodzie i dodać matrycę Matrigel do 10% końcowej objętości (końcowe stężenie: 0,8 do 1,1 mg/ml). Delikatnie dodaj 250 μl mieszaniny pożywki z matrycą Matrigel do posianej hodowli.

Uwaga: Pożywka musi być dokładnie schłodzona przed dodaniem matrycy Matrigel, aby zapewnić jednorodne mieszanie i równomierne osadzanie matrycy Matrigel na komórkach w hodowli. Odmierzyć pipetą mieszaninę pożywki z matrycą Matrigel z boku studzienki, aby uniknąć naruszenia komórek lub matrycy Matrigel.

6. Hodować nieprzerwanie przez 4 do 7 dni i wymieniać mieszaninę pożywki z matrycą Matrigel co 2 dni.

7. Zaleca się barwienie immunologiczne hodowli 3D i obserwację morfologii komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Protokół 2. Osadzona hodowla MDCK 3D

1. Rozmrozić matrycę błony podstawnej Corning^® Matrigel^® przez noc, zanurzając fiolkę w lodzie w lodówce o temperaturze 4 °C przed użyciem. Po rozmrożeniu matrycy Matrigel, zawirować fiolkę, aby upewnić się, że materiał jest rozproszony.

2. W dniu 0, rozcieńczyć matrycę Matrigel do 5 mg/ml z lodowatym podłożem do pełnej hodowli komórek MDCK (MEM + 10% FBS).

Uwaga: Przechowywać wszystkie naczynia hodowlane i odczynniki mające kontakt z matrycą Matrigel na lodzie podczas całego procesu.

3. Używając wstępnie schłodzonych końcówek, pokryć wstępnie schłodzoną 24-dołkową płytkę, dodając 100 μL matrycy Matrigel (5 mg / ml) do każdego dołka, równomiernie rozprowadzić końcówką pipety i inkubować w 37 ° C przez 30 minut, aby utworzyć żel.

Uwaga: Nie przesuszaj matrycy Matrigel podczas procesu żelowania.

4. Trypsynuj komórki MDCK z monowarstwy, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową, a następnie osusz komórki poprzez wirowanie przy 125 x g przez 5 min. w temperaturze pokojowej (RT). w temperaturze pokojowej (RT).

Uwaga: Użyj komórek, które są zdrowe i nie przekraczają 85% konfluencji. Komórki MDCK mają tendencję do tworzenia skupisk komórek; dlatego często konieczne jest ich energiczne pipetowanie w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.

5. Ponownie zawiesić komórki w kompletnej pożywce MDCK i dostosować gęstość komórek do 5 × 106 komórek/ml. Dodaj 30 μL przygotowanej zawiesiny komórek do 270 μL roztworu matrycy Matrigel (5 mg/ml), który jest przechowywany na lodzie, aby końcowa gęstość komórek wynosiła 5 x 105 komórek/ml. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 do 45 minut.

Uwaga: Objętość komórek nie powinna przekraczać 10% roztworu Matrigel, aby zapewnić prawidłową polimeryzację rozcieńczonego roztworu Matrigel w matrycę. Liczba komórek może wymagać optymalizacji w zależności od właściwości wzrostu linii komórkowej.

6. Delikatnie dodaj 500 μL kompletnej pożywki MDCK do każdej studzienki.

7. Prowadzić hodowlę przez 8 do 10 dni i zmieniać pożywkę co 2 dni.

8. Zaleca się immunobarwienie hodowli 3D i obserwację morfologii komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Referencje

1. Lee GY, Kenny PA, Lee EH, Bissell MJ. 2007. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4(4):359-365. https://doi.org/10.1038/nmeth1015

2. Elia N, Lippincott‐Schwartz J. 2009. Culturing MDCK Cells in Three Dimensions for Analyzing Intracellular Dynamics. CP Cell Biology. 43(1): https://doi.org/10.1002/0471143030.cb0422s43