Papain, cisztein-proteáz, tulajdonságok és termékek

E.C. 3.4.22.2

Papaya (Carica papaya)

• Fizikai tulajdonságok
• Specifikusság
• Alkalmazások
• Lioldhatóság és oldatstabilitás
• Kapcsolódó termékek
• Referenciák

 

Fizikai tulajdonságok és kinetika

A pápain a peptidáz C1 családba tartozó cisztein-proteáz. A papain egyetlen polipeptidláncból áll, három diszulfidhíddal és az enzim aktivitásához szükséges szulfhidrilcsoporttal. 

Molekulatömeg: 23.406 Da (aminosav szekvencia)¹⁶
Az aktivitáshoz szükséges optimális pH: 6.0-7,0
Aktivitáshoz optimális hőmérséklet: 65 °C²²
pI: 8,75 ¹⁷; 9.55 ¹⁸ Spektrális tulajdonságok:
λ_max: 278 nm ¹⁹
Extinkciós együttható, E^1% = 25 ¹⁹
Extinkciós együttható, EmM = 57.6 (280 nm-en) ²⁰

Meghatározás: Egység meghatározása: Egy egység percenként 1,0 µmol N-α-benzoil-L-arginin etil-észtert (BAEE) hidrolizál pH 6,2-nél, 25 °C-on.

1. ábra. A papain enzim szerkezete.

Specificity

A pápain a legtöbb fehérje szubsztrátot nagyobb mértékben emészti meg, mint a hasnyálmirigy proteázok. A papain széles specificitást mutat, bázikus aminosavak, leucin vagy glicin peptidkötéseit hasítja. Hidrolizálja az észtereket és az amidokat is. A papain előnyben részesíti a P2 pozícióban nagy hidrofób oldallánccal rendelkező aminosavakat. Nem fogadja el a Val-t a P1' pozícióban.¹

Alkalmazások

• A papain általában sejtizolációs eljárásokban használatos, ahol bizonyos szövetek esetében hatékonyabbnak és kevésbé pusztítónak bizonyult, mint más proteázok. Például a papaint életképes, morfológiailag ép agykérgi neuronok izolálására használták posztnatális patkányokból.² Papainkészítményünk (Termékszám. P4762) a simaizomsejtek izolálására használtuk.^3,4 Megállapítottuk, hogy a papain jelentősen növeli az életképes simaizomsejtek hozamát, miközben nem befolyásolja a sejtek stimulánsokkal szembeni érzékenységét.⁵
• A papain korlátozott mértékű emésztése hasznosnak bizonyult enzimek és más fehérjék szerkezeti vizsgálatához.^6-8
• A papain a vörösvérsejt-szerológiában a vörösvérsejtek felszínének módosítására szolgál, hogy a csoportosítási, antitestszűrési vagy antitest-azonosítási eljárások kiegészítéseként számos vörösvérsejt-antigén reaktivitását fokozza vagy megsemmisítse. A papain a vérlemezke-szerológiában is hasznosnak bizonyult.⁹
• A papaint aminosavak, peptidek és más molekulák enzimatikus szintézisében is használják.^10-13
• Fab és F(ab')₂ antitest fragmentumokat használnak olyan vizsgálati rendszerekben, ahol az F_c régió jelenléte problémát okozhat. Ezekben az esetekben előnyösebb, ha csak az antitest antigénkötő (Fab) részét használják. Az IgG-ből származó Fab-fragmentumok előállítására rutinszerűen papaint használnak. Az IgM is emészthető papainnal, ami nagy hozamú homogén Fab-készítményeket eredményez.¹⁵
• A papain az antitesteket két Fab-fragmentumra, amelyek specifikusan felismerik az antigént a változó régiójukkal, és egy F_c fragmentumra hasítja.¹⁴ A nehézláncokat összekötő diszulfidkötéseket tartalmazó csuklós régió felett, de a könnyűlánc és a nehézlánc közötti diszulfidkötés helye alatt hasítja. Ezáltal két különálló monovalens (egyetlen antitestkötő helyet tartalmazó) Fab-fragmentum és egy intakt F_c fragmentum keletkezik. A fragmentumok gélszűréssel, ioncserével vagy affinitáskromatográfiával tisztíthatók. Az antitestek emésztésére és az antitest fragmentumok tisztítására vonatkozó protokollok megtalálhatók az Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow és D. Lane, szerk., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988.
• A szövetekben, például a nyirokcsomókban vagy a lépben, vagy a perifériás vérkészítményekben F_c receptorokkal rendelkező sejtek (makrofágok, monociták, B-limfociták és természetes ölősejtek) vannak jelen, amelyek képesek megkötni az intakt antitestek F_c régióját, háttérfestést okozva olyan területeken, amelyek nem tartalmazzák a célantigént. A Fab-fragmentumok használata biztosítja, hogy az antitestek az antigénhez és nem az F_c receptorokhoz kötődnek. Ezek a fragmentumok kívánatosak lehetnek sejtkészítmények festéséhez plazma jelenlétében, mivel nem képesek komplementet kötni, amely lízisre késztetné a sejteket. A Fab-fragmentumok lehetővé teszik a célantigén pontosabb lokalizációját, pl. szövetek festése esetén elektronmikroszkópiához.

2. ábra. A pepszin és a papain hasításának ábrázolása.

Solubility and Solution Stability

A papain 10 mg/ml oldhatóságú vízben oldódik. Közvetlenül felhasználás előtt az enzimet jellemzően ~5 mM L-ciszteint tartalmazó pufferben hígítjuk. Az aktiváló/stabilizáló szerek közé tartozik az EDTA, a cisztein és a dimerkaptopropanol.²¹

A papain oldatok jó hőmérsékleti stabilitással rendelkeznek, az oldat stabilitása azonban pH-függő. A papainoldatok savas körülmények között instabilak, azaz 2,8 alatti pH-értékeknél jelentős aktivitásvesztés következik be. Az oldatban lévő aktív enzim esetében az aktivitásvesztés körülbelül 1-2% naponta, valószínűleg az autolízis és/vagy oxidáció eredményeként.

A papain izolálás során kapott gyakori inaktív formája a fehérje aktív helyének szulfhidrilcsoportja és a szabad cisztein között kialakuló kevert diszulfid.²³

A papain oldatok több denaturáló szerrel szemben is stabilak, ill, 70%-os metanolban és 8 M karbamidoldatban történő átkristályosítás után is megmarad a teljes aktivitás. Jelentős aktivitásvesztés következik be azonban, amikor a papain 10%-os triklórecetsavval vagy 6 M guanidin-hidrokloriddal kerül érintkezésbe.

Kapcsolódó termékek

Hivatkozások

1. GP Moss. [Internet]. EC 3.4.22.2: International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB).[updated 05 Jun 2020; cited 17 Jul 2020]. Available from: https://www.qmul.ac.uk/sbcs/iubmb/enzyme/EC3/4/22/2

2. Kinoshita K, Sato K, Hori M, Ozaki H, Karaki H. 2003. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-?B inhibitors in Crohn's colitis model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 285(3):G483-G493. https://doi.org/10.1152/ajpgi.00038.2003

3. Driska SP, Laudadio RE, Wolfson MR, Shaffer TH. 1999. A method for isolating adult and neonatal airway smooth muscle cells and measuring shortening velocity. Journal of Applied Physiology. 86(1):427-435. https://doi.org/10.1152/jappl.1999.86.1.427

4. HASEGAWA M, KOBAYASHI M, OYAMADA H, KAMISHIMA T, YOSHIDA C, OHATA H, MARUYAMA I, MOMOSE K, GOMI Y. 1987. Studies on isolated smooth muscle cells. IX Application of papain for isolation of single smooth muscle cells from guinea-pig taenia coli.. Jpn. J. Smooth Muscle Res.. 23(1):35-46. https://doi.org/10.1540/jsmr1965.23.35

5. Margossian SS, Lowey S. 1973. Substructure of the myosin molecule. Journal of Molecular Biology. 74(3):301-311. https://doi.org/10.1016/0022-2836(73)90375-6

6. Margossian SS, Lowey S. 1973. Substructure of the myosin molecule. Journal of Molecular Biology. 74(3):313-330. https://doi.org/10.1016/0022-2836(73)90376-8

7. Shiozaki K, Yanagida M. 1991. A functional 125-kDa core polypeptide of fission yeast DNA topoisomerase II.. Mol. Cell. Biol.. 11(12):6093-6102. https://doi.org/10.1128/mcb.11.12.6093

8. Kyer CI. 1995. Information technology law: What does the future hold?. Computer Law & Security Review. 11(3):140-142. https://doi.org/10.1016/s0267-3649(00)80035-7

9. ?-Nitro-?-amino acids as latent ?,?-dehydro-?-amino acid residues in solid-phase peptide synthesis. 2004(10):101. https://doi.org/10.3998/ark.5550190.0005.a11

10. Rajesh M, Kapila S, Nam P, Forciniti D, Lorbert S, Schasteen C. 2003. Enzymatic Synthesis and Characterization ofl-Methionine and 2-Hydroxy-4-(methylthio)butanoic Acid (HMB) Co-oligomers. J. Agric. Food Chem.. 51(9):2461-2467. https://doi.org/10.1021/jf026093g

11. Fukuoka T, Tachibana Y, Tonami H, Uyama H, Kobayashi S. 2002. Enzymatic Polymerization of Tyrosine Derivatives. Peroxidase- and Protease-Catalyzed Synthesis of Poly(tyrosine)s with Different Structures. Biomacromolecules. 3(4):768-774. https://doi.org/10.1021/bm020016c

12. Burton SG, Cowan DA, Woodley JM. 2002. The search for the ideal biocatalyst. Nat Biotechnol. 20(1):37-45. https://doi.org/10.1038/nbt0102-37

13. Greenfield E. 2014. Antibodies: A Laboratory Manual. 2. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

14. NEWKIRK MM, EDMUNDSON A, WISTAR R, KLAPPER DG, CAPRA JD. 1987. A New Protocol to Digest Human IgM with Papain that Results in Homogeneous Fab Preparations that Can Be Routinely Crystallized. Hybridoma. 6(5):453-460. https://doi.org/10.1089/hyb.1987.6.453

15. Mitchel R, Chaiken I, Smith E. 1970. The Complete Amino Acid Sequence of Papain. J. Biol. Chem. 2453485-3492.

16. Smith EL, Kimmel JR, Brown DM. 1954. CRYSTALLINE PAPAIN: II. PHYSICAL STUDIES; THE MERCURY COMPLEX. J. Biol. Chem.. 207533-549.

17. Sluyterman L, de Graaf M. 1972. The effect of salts upon the pH dependence of the activity of papain and succinyl-papain. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 258(2):554-561. https://doi.org/10.1016/0005-2744(72)90247-1

18. Glazer AN, Smith EL. 1961. Phenolic Hydroxyl Ionization in Papain. J. Biol. Chem.. 2362948-51.

19. Pace CN, Vajdos F, Fee L, Grimsley G, Gray T. 1995. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci.. 4(11):2411-2423. https://doi.org/10.1002/pro.5560041120

20. Arnon R. 1970. [14] Papain.226-244. https://doi.org/10.1016/0076-6879(70)19017-3

21. Kilara A, Shahani KM, Wagner FW. 1977. Preparation and properties of immobilized papain and lipase. Biotechnol. Bioeng.. 19(11):1703-1714. https://doi.org/10.1002/bit.260191109

22. Klein IB, Kirsch JF. 1969. The Activation of Papain and the Inhibition of the Active Enzyme by Carbonyl Reagents. J. Biol. Chem.. 2445928-5935.