Szöveti disszociációs útmutató: Kollagenáz, diszpáz és liberáz enzimtípusok

Általános információk a szövetbontó enzimjeinkről

• Kollagenáz enzimeink leírása
• Kollagenáz enzim termékeink
• Kollagenáz enzim termékek
/a>
• Kollagenáz és Liberáz^® Enzimek a Roche-tól
• Kollagenáz tesztek
• Kollagenáz szövetemésztés/szövetbontás hibaelhárítás és referenciák

A kollagenázok olyan enzimek, amelyek lebontják az állati szöveteket összetartó natív kollagént, és amelyeket számos mikroorganizmus és számos különböző állati sejt állít elő¹. A leghatásosabb kollagenáz az anaerob baktériumok Clostridium histolyticum által szekretált "nyers" kollagenáz. Eredetileg a MacLennan, Mandl és Howes² által leírt 1953-as fermentációs és tisztítási eljárást vettük át, de végül továbbfejlesztettük a nagyobb aktivitású termékek érdekében. A "nyers" kollagenáz arra utal, hogy az anyag a kollagenázon kívül több különböző enzim keveréke, amelyek együttesen hatnak a szövetek lebontására. Ma már ismert, hogy a kollagenáz enzimnek két formája van jelen^3,4. Néhány kivételtől eltekintve a különböző kereskedelmi forgalomban kapható kollagenázok mindegyike C. histolyticum-ból készül, vagy olyan rekombináns változatok, ahol Escherichia coli expresszál egy C. histolyticum-ból klónozott gént.

Kollagenáz enzimeink leírása

Az alábbi táblázatokban szereplő különböző kollagenáz termékeket azért fejlesztettük ki, mert mindegyikük bizonyos típusú szöveteket (izom, hasnyálmirigy, szív, zsírszövet) jobban emészt, mint másokat. Az enzimaktivitási előírásoknak való megfelelésen túlmenően kollagenáz termékeink minden tételének át kell mennie különböző patkányoktól származó szövetekkel végzett emésztési teszteken. A "sejtkultúrában tesztelt" megjelöléssel is ellátott termékek további teszteken estek át emlős sejtvonalakkal annak igazolására, hogy nem citotoxikusak.

Szterilszűrt (0.2 mm-es) változatok, amelyeket néhány népszerűbb kollagenáz termékből készítettünk, szintén az alábbiakban szerepelnek.

A tisztított kollagenáz termékeink csak nyomokban tartalmaznak kazeináz (proteolitikus) vagy klosztripain aktivitást. A tisztított VII. típusú kollagenázt sejtkultúrában tesztelt és sterilszűrős változatban is kínáljuk.

Kollagenáz enzimtermékek - nyers kollagenáz, kromatográfiailag tisztított, kollagenáz proteolitikus aktivitás gátlóval és keverékek

Általános felhasználásra szánt nyers kollagenáz

a, b FALGPA és kollagenáz emésztési egységek (CDU), mindkettő mg/szilárd anyagra vonatkoztatott egységben megadva.

Termék	Kommentárok	FALGPAa	CDUsb
C0130	Általános használatra	0.25 - 1.0	> 125
C1639, I-S típus	A C0130 szűrt változata	0.25 - 1.0	> 125
C9891, IA típus	Az I. típus második változata általános használatra	0.5 - 2.0	> 125
C2674, IA típus	A C9891 sejtkultúrán tesztelt változata	0.5 - 2.0	> 125
C5894, IA-S típus	A C9891 szűrt változata	0.5 - 2.0	> 125
C9722, IA-S típus		A C9891 sejtkultúrán tesztelt és steril szűrésű változata	0.5 - 2.0	> 125

Kolagénáz nyers, felhasználás-ellenőrzött

a, b FALGPA és kollagenáz emésztési egységek (CDU), mindkettő mg/szilárd anyagra vonatkoztatott egységben megadva.

Termék	Kommentárok	FALGPA a	CDUs b
C6885, II. típus	Teszteltük, hogy alkalmas az inzulin5,6	0.5 - 2.0	> 125
C1764, II-S típus		A C6885 szűrt változata	0.5 - 2.0	> 125
C5138, IV. típus	Teszteltük, hogy alkalmas életképes patkánymájsejtek (hepatociták)7	0.5 - 2.0	> 125
C1889, IV-S típus	A C5138 szűrt változata	0.5 - 2.0	> 125
C2139, VIII. típus	Teljesítette a zsírszöveti vizsgálatot (lásd C6885)5, 6 és a májszöveti vizsgálatot (lásd C5138)7	0.5 - 2.0	> 125
C9263, V. típus	Patkányok hasnyálmirigyéből8,9	1. Patkányok hasnyálmirigyéből származó Langerhans-szigetsejtek (inzulintermelő sejtek) feltárására és felszabadítására alkalmasnak bizonyult8,9	.0 - 3.0	> 125
C2014, V-S típus		A C9263 szűrt változata	1.0 - 3.0	> 125
C7657, XI. típus		A legmagasabb kollagenáz aktivitással rendelkezik - patkány hasnyálmirigyből származó Langerhans-szigetek (inzulintermelő sejtek) emésztésére és felszabadítására alkalmasnak bizonyult8,9	2.0 - 5.0	> 1,200
C9407, XI. típus		Cellakultúrán tesztelt változata a C7657-nek	2.0 - 5.0	> 1,200
C4785, XI-S típus		A C7657 szűrt változata	2.0 - 5.0	> 1,200
C9697, XI-S típus		A C7657 sejtkultúrán tesztelt és sterilszűrésű változata	2.0 - 5.0	> 1,200

Kromatográfiailag tisztított kollagenáz

a, b FALGPA és kollagenáz emésztési egységek (CDU), mindkettő mg/szilárd anyagra vonatkoztatott egységben megadva.

Termék	Kommentárok	FALGPAa	CDUsb
C0255, III. típus		Tisztított kollagenáz, amely nyomokban proteáz aktivitást mutat	4 - 12	≥ 250
C0773, VII-es típus	Proteáztól és klosztripáintól lényegében mentes tisztított kollagenáz	4 - 12	1,000 - 3,000
C2799, VII. típus		A C0773 sejtkultúrában tesztelt változata	4 - 12	1,000 - 3,000
C2399, VII-S típus	A C0773 szűréssel szűrt változata	Szterilszűréssel szűrt változata	4 - 12	1,000 - 3,000
C9572, VII-S típus	A C0773 sejtkultúrán tesztelt és sterilszűrős változata	4 - 12	1.000 - 3.000

Proteolitikus aktivitást gátló nyers kollagenáz

a, b FALGPA és kollagenáz emésztési egységek (CDU), mindkettő mg/szilárd anyagra vonatkoztatott egységben megadva.

Termék	Kommentárok	FALGPA a	CDUs b
C6079, S típusú		XI típusú kollagenáz keveréke triptikus proteáz inhibitorral. Patkányok hasnyálmirigyéből származó Langerhans-szigetsejtek (inzulintermelő sejtek) emésztésére és felszabadítására alkalmasnak bizonyult8, 9	Minimum 1.000

Collagenase Blends™

Ezeket a termékeket a kollagenáz emésztések nagyobb tételenkénti reprodukálhatósága érdekében fejlesztették ki. A H és L keverékekben a tisztított kollagenáz (Blend F) és a tisztított klosztridiumos semleges proteáz aránya változik, hogy a kutatóknak többféle emésztési lehetőséget biztosítsanak.

a, c FALGPA és kollagenáz emésztési egységek (CDU), mindkettő mg/szilárd anyagra vonatkoztatott egységben megadva.

Termék	Kommentárok	FALGPAa	Proteasec
C7926, Blend F		Főleg valódi kollagenázok. Mivel a FALGPA aktivitása magas a CDU-hoz képest, feltételezhető, hogy a kollagenáz II-es típusú formája van jelen többnyire	Min. 2.0	< 10
C8051, H keverék		A kollagenáz aktivitással együtt némi semleges proteáz aktivitás	Min. 1,0	Min. 10
C8176, Blend L<	A valódi kollagenázzal több semleges proteáz aktivitást tartalmaz	< 1.0	Min. 40

Kollagenáz és Liberáz^® enzimek a Roche-tól

A Roche kollagenáz enzimeit intuitív módon tervezték, és megbíznak bennük, hogy következetes teljesítményt és reprodukálható eredményeket biztosítsanak a rutinszerű és kritikus alkalmazásokhoz. A kollagenáz számos szövettípusból származó sejtek, például hepatociták, adipociták, hasnyálmirigy-szigetsejtek, hámsejtek, izomsejtek és endotélsejtek előkészítésére alkalmas. Az enzim egyes tételeinek alkalmasságát egy szövet felbontására azonban empirikusan kell meghatározni. Ezen kívül a Liberase^® enzimtechnológiánk a nagy tisztaságú kollagenáz I és II enzimeket Dispase^® vagy Thermolysin enzimmel kombinálja, hogy megkönnyítse a szövetek széles körének disszociációját.

Liberase Research Grade alkalmazási útmutató

*Az adatok publikációkon alapulnak

Szövettípus	TL	TM	TH	DL	DH
Máj		+<<			+
Vese			+		++
Bőr					+	++
Szív		+	+	/td>		+
Béldaganat (szigetek)		++			+
Nyirokcsomó*	++	+
Penpe*	++
Tüdő*		++	++	++
Petefészekszövet*<			++
Szövetek*		++
Cornea*				++

Diszpáz enzimek

A Roche-tól kapható enzimekkel együtt elkötelezettek vagyunk amellett, hogy olyan szövetdiszszociációs reagenseket biztosítsunk, amelyek magas tisztaságúak és megbízhatóak az Ön speciális alkalmazási igényeihez. A sejtmembránokat nem károsító, kíméletes enzim, a diszpáz alkalmas különféle szövetek és sejtek szétválasztására, amelyeket in vitro tenyésztünk, valamint a sejtek csomósodásának megakadályozására szuszpenziós kultúrák esetében.

Kollagenáz Assays

A tisztított kollagenáz enzimek I. és II. típusú formái különböznek a natív kollagénre és a szintetikus szubsztrátokra vonatkozó specifitásuk és relatív aktivitásuk tekintetében. E két kollagenáz leginkább azáltal különböztethető meg, hogy a vizsgálatainkban használt két különböző szubsztrát valamelyikét részesítik előnyben. A kollagenáz emésztőegység (CDU) vizsgálat^10,11 elsősorban a kollagenáz I aktivitást méri, amely a hosszú, nem denaturált kollagénfehérje három spirális láncából kettőt hasít. A kollagenáz II aktivitást úgy mérjük, hogy ez az enzim képes egy rövid szintetikus peptid, az N-[3-(2-(2-Furil)acryloyl)]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA, lásd a termékszámot. F5135), egy második kollagenáz emésztési tesztben^12,13. Kimutatták, hogy a kollagenáz I vagy II tisztított készítményei kevésbé hatékonyak a különböző típusú kollagén vagy emlősszövetek emésztésében, mint az enzim mindkét formájának keveréke. Az enzimnek csak a kollagenáz I. és II. formáját tartalmazó tisztított kollagenáz kevésbé hatékony a szövetek emésztésében, mint a teljes nyers kollagenáz vagy a tisztított kollagenáz és különböző proteázok kombinációi. Nyilvánvaló, hogy a valódi kollagenáz és a természetben kialakult különböző natív proteázok, klosztripain és aminopeptidázok kombinációja segíti egymást a különböző állati szövetek kollagénjének emésztésében. A szövetek emésztésére mindig is a nyers kollagenáz termékek voltak a leghatékonyabbak. Egyes kutatók a szövetek emésztésére a kromatográfiailag tisztított kollagenáz és egy proteáz, például tripszin vagy szubtilizin keverékét próbálták ki.

A kollagenáz aktivitásra vonatkozó CDU és FALGPA vizsgálatokon kívül minden terméktételt tesztelünk kazeináz^14,15, klosztripain és triptikus aktivitásra, hogy megvizsgáljuk a kollagenáz termékek proteolitikus enzimaktivitását. A kazeináz vizsgálat a három közül a legfontosabb az állati szövetek emésztését segítő proteolitikus aktivitás mérésére. Mivel a nyers kollagenázban jelenlévő klosztripáint csökkenteni kell (pl. ditiotreitollal való kezeléssel) ahhoz, hogy aktív legyen, ez az enzim valószínűleg kevéssé járul hozzá a szövetek laboratóriumi disszociációs folyamatához. Ellenőrzik, mert egyes kutatók arról számoltak be, hogy a klosztripain káros vagy mérgező lehet.

Sok olyan kollagenáz terméket, amelyek megfelelnek az enzimatikus specifikációknak, patkányokból nyert különböző szövetekkel is teszteltek. A II. típusú (C6885, C1764) és a VIII. típusú (C2139) kollagenáz tételeket teszteltük a patkányok mellékhere zsírpárnáiból⁵ a zsírsejtek (zsír) felszabadításának képességét. A zsírsejteket ezután metabolikus aktivitás szempontjából vizsgálják glükózoxidációs sebesség mérésével, inzulin hozzáadásával és anélkül. A IV. típusú (C5138, C1889) és a VIII. típusú (C2139) tételek esetében vizsgálták, hogy képesek-e életképes sejteket felszabadítani patkánymájból⁷. Az V. típusú (C9263, C2014), a XI. típusú (C7657, C4785, C9407, és C9697) és S típus (C6079) kollagenáz tételeknek ép Langerhans-szigeteket kell felszabadítaniuk patkány hasnyálmirigyből, hogy átmenjenek a terméktesztjükön⁸.

Kollagenázzal történő szövetemésztés/bontás hibaelhárítás és referenciák

A saját kutatás-fejlesztésünk és az ügyfelekkel folytatott megbeszélések alapján egyértelmű, hogy az adott szövet boncolásának és előkészítésének módja jelentős hatással van a kollagenázzal történő szövetemésztés/bontás sebességére és hatékonyságára. A szövetdonorok életkorának különbségei is jelentős eltérést okozhatnak az időbeli eltérésekben. Győződjön meg arról, hogy az emésztési pufferekben 5 mM kalciumion van jelen. Az EGTA és EDTA kelátképző szerek súlyosan gátolhatják a kollagenáz aktivitását az enzim stabilitásához és aktivitásához szükséges kalciumionok eltávolításával. β-merkaptoetanol¹⁶, cisztein¹⁶ és 8-hidroxikinolin-5-szulfonát¹⁶ ;egyéb gátló anyagok. A magasabb specifikus aktivitású kollagenáz új tétele egy meghatározott koncentrációban túlzott sejthalált okozhat. Ebben az esetben használjon kevesebb kollagenázt és/vagy adjon hozzá BSA-t vagy szérumot (legfeljebb 0,5%, illetve 5-10%), hogy stabilizálja a sejteket a további emésztéshez.

Probléma	Az ok	Megoldás	Hivatkozás
Az emésztés rossz./td>	Inaktív enzimek Nem megfelelő Ca++ Elégtelen enzimek	Hidegen és szárazon tárolja a kollagenázt. Tárolja a kollagenázoldatot fagyasztott aliquotokban. A kollagenázoldatba 5 mM Ca++ -t tegyen. Használjon több kollagenázt. Próbálja ki a több proteáz aktivitást tartalmazó keverékeinket.	6 7
A felszabadult sejtek csapdába esnek	A felbomlott sejtekből felszabaduló DNS Nem megfelelő nem fehérje gumik	Visszavehetjük a keverést DNSse hozzáadása** A szövetet jól átöblítjük az emésztés előtt*** Nem használunk Mg++ -t az emésztőoldatban Adjunk hozzá hialuronidázt enzimekkel**	7 9 7 7 7< 18
A sejtek elpusztulnak	Túl sok proteáz pH-változás Túl kevés oxigén	Visszaszorítja a proteázoknak való kitettséget* Albumin vagy melegített szérum hozzáadása Pufferek használata (pl.pl. HEPES) a HCO-3 helyett. Ellenőrizze és állítsa be gyakran a pH-t Légtelenítse az emésztőoldatot (levegővel vagy O2) Gyorsabb emésztés több enzim felhasználásával	7 19
Alacsony a sejtkihozatal	Enzimegyensúly Adhéziós faktorok	Nagyobb mennyiségű kollagenázt használjunk* A kollagenázhoz adjunk elasztázt** Előbb perfundáljuk a szövetet a Ca++*** eltávolítása érdekében	20 7
Sok sejt károsodik	Túl sok proteáz	Túl sok proteáz Fizikai károsodás	Kevesebb proteázt használjon* Adjon hozzá albumint vagy melegített szérumot Kezelje a szöveteket és sejteket nagyon óvatosan	21 7
Új tétel Nem működik	Tételváltozatok	Frakcionált kollagenáz "keverékeket" használjon (termékszám. C7926, C8051 vagy C8176)*

* A "Blend" termékekben külön-külön előállított kollagenáz és proteáz enzimek (No. C7926, C8051, C8051./a> vagy C8176) segítségével reprodukálhatóan ellenőrizhető, hogy az egyes termékekből mennyi kerül felhasználásra.

** A DNSse inaktiválódik a túlzott keverés nyíróhatása miatt, és a hozzáadott enzimeket a kollagenázban jelen lévő semleges proteáz emésztheti.

*** Használjon EGTA-t (vagy EDTA-t) a Ca++ eltávolításához és a mikroorganizmusok kiöblítéséhez, majd mossa ki a szövetet pufferrel a kelátképző szer eltávolításához. Ne adjon EGTA-t vagy EDTA-t az enzimoldatokhoz!

Hivatkozások

1. Harper E. 1980. Collagenases. Annu. Rev. Biochem.. 49(1):1063-1078. https://doi.org/10.1146/annurev.bi.49.070180.005215

2. MacLennan JD, Mandl I, Howes EL. 1953. BACTERIAL DIGESTION OF COLLAGEN 1. J. Clin. Invest.. 32(12):1317-1322. https://doi.org/10.1172/jci102860

3. Bond MD, Van Wart HE. 1984. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23(13):3085-3091. https://doi.org/10.1021/bi00308a036

4. Matsushita O, Jung C, Katayama S, Minami J, Takahashi Y, Okabe A. 1999. Gene Duplication and Multiplicity of Collagenases in Clostridium histolyticum. J. Bacteriol.. 181(3):923-933. https://doi.org/10.1128/jb.181.3.923-933.1999

5. Rodbell M. 1964. Metabolism of Isolated Fat Cells. Journal of Biological Chemistry. 239(2):375-380. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)51687-2

6. Fain JN. 1975. [53] Isolation of free brown and white fat cells.555-561. https://doi.org/10.1016/0076-6879(75)35184-7

7. Seglen PO. 1976. Chapter 4 Preparation of Isolated Rat Liver Cells.29-83. https://doi.org/10.1016/s0091-679x(08)61797-5

8. Lacy PE, Kostianovsky M. 1967. Method for the Isolation of Intact Islets of Langerhans from the Rat Pancreas. Diabetes. 16(1):35-39. https://doi.org/10.2337/diab.16.1.35

9. Buitrago A, Gylfe E, Henriksson C, Pertoft H. 1977. Rapid isolation of pancreatic islets from collagenase digested pancreas by sedimentation through percoll? at unit gravity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 79(3):823-828. https://doi.org/10.1016/0006-291x(77)91185-8

10. Moore S, Stein WH. 1948. PHOTOMETRIC NINHYDRIN METHOD FOR USE IN THE CHROMATOGRAPHY OF AMINO ACIDS. Journal of Biological Chemistry. 176(1):367-388. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)51034-6

11. “Enzymatic Assay of Collagenase. Collagen Digestion Assay”, our quality control test procedure..

12. Van Wart HE, Steinbrink D. 1981. A continuous spectrophotometric assay for Clostridium histolyticum collagenase. Analytical Biochemistry. 113(2):356-365. https://doi.org/10.1016/0003-2697(81)90089-0

13. “Enzymatic Assay of Collagenase Using FALGPA as the Substrate”, our quality control test procedure..

14. Anson M, Gen. Physiol. J. The Estimitation of Pepsin, Trypsin, Papain and Cathepsin with Hemoglobin. 22, 79 (1938).

15. “Enzymatic Assay of Caseinase (Collagenase Products)”, our quality control test procedure..

16. Seifter S, Gallop PM, Klein L, Meilman E. 1959. Studies on Collagen. Journal of Biological Chemistry. 234(2):285-293. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)70290-1

17. Berry MN, Friend DS. 1969. HIGH-YIELD PREPARATION OF ISOLATED RAT LIVER PARENCHYMAL CELLS. 43(3):506-520. https://doi.org/10.1083/jcb.43.3.506

18. Bellemann P, Gebhardt R, Mecke D. 1977. An improved method for the isolation of hepatocytes from liver slices. Analytical Biochemistry. 81(2):408-415. https://doi.org/10.1016/0003-2697(77)90711-4

19. Ives HE, Schultz GS, Galardy RE, Jamieson JD. 1978. Preparation of functional smooth muscle cells from the rabbit aorta.. 148(5):1400-1413. https://doi.org/10.1084/jem.148.5.1400

20. Fain JN, Loken SC. 1969. Response of Trypsin-treated Brown and White Fat Cells to Hormones. Journal of Biological Chemistry. 244(13):3500-3506. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)83400-7

21. Berry, M, Edwards, Aa, Barritt, G. 1991. Isolated Hepatocytes; Preparation, Properties and Applications. Elsevier. .