Fehérje-expressziós rendszerek

Bevezetés

A géntechnológia és a klónozás fejlődése számos lehetőséget nyitott meg a heterológ fehérjék kutatási célú expressziójára és izolálására. A technológia jelentős fejlődése lehetővé tette a rekombináns fehérjék nagymértékű expresszióját és izolálását. A nagy léptékű alkalmazásokhoz, például enzimek, antitestek vagy vakcinák előállításához azonban jelentős mennyiségű fehérjére van szükség. Ilyen esetekben a rendszernek, amelyben a fehérjét kifejezik, könnyen tenyészthetőnek és fenntarthatónak, gyorsan növőnek és nagy mennyiségű fehérjét termelőnek kell lennie. Az emlősfehérjék ráadásul különböző poszttranszlációs módosításokon is átesnek. Ezek a követelmények vezettek a fehérjeexpressziós rendszerek felfedezéséhez. A különböző fehérje-expressziós rendszerek baktérium, élesztő, rovar vagy emlős rendszerek.

A rekombináns fehérjék előállítására használt expressziós rendszer típusát a következő tényezők határozzák meg:

• a fehérje expressziójára fordított idő
• a expressziós rendszer könnyű kezelhetősége
• a szükséges fehérjemennyiség
• a fehérje tömege
• a poszttranszlációs módosítások típusa, a diszulfidkötések száma
• a kifejezett fehérje célállomása

A rekombináns fehérje expressziós rendszerben történő kifejezési folyamatához a következő információkra/összetevőkre van szükség.

• a kívánt fehérjét kódoló gén azonosítása
• cDNS előállítása a megfelelő mRNS-ből
• megfelelő expressziós vektor kiválasztása a génszekvencia beillesztéséhez
• a vektort kifejezni képes megfelelő rendszer kiválasztása
• megfelelő szűrési és méretnövelési módszerek

A kívánt rekombináns fehérje előállításának alapvető lépései hasonlóak a különböző expressziós rendszerekben (1. ábra).

1. ábra. A fehérjeexpressziós rendszer optimalizálásának lépései a kívánt rekombináns fehérje előállítása érdekében

Bakteriális fehérjeexpressziós rendszerek - Escherichia coli

A baktériumok a rekombináns fehérjék expressziójának gyors és egyszerű rendszerei, mivel rövid megduplázódási idejük miatt. A tenyésztésükhöz szükséges táptalajok nem drágák, és a bioprodukció méretnöveléséhez igazított módszerek egyszerűek. A legszélesebb körben használt gazdarendszer az E. coli, mivel genetikai, genomszekvencia- és fiziológiai ismeretekkel rendelkezik. A genetikai manipuláció könnyű, és nagy sűrűségűre is nő, és alkalmas nagyléptékű fermentációra. Az E. coli sejtfala azonban toxikus pirogéneket tartalmaz, és a kifejezett fehérjéket felhasználás előtt alaposan tesztelni kell.

2. ábra. Bakteriális fehérje expressziós rendszer - Escherichia coli

A fehérjeexpresszió az E. coli segítségével a következő lépésekből áll:

• kompetens E. coli -i> felhasználása. coli  (katalógusszámok CMC0001, CMC0004, CMC0004, CMC0014) sejtek az érdeklődésre számot tartó DNS-szekvencia felvételére
• a DNS beépítése a bakteriális genomba vagy a DNS-szekvencia cirkularizációja, hogy plazmidként létezzen
• a transzformált E. coli szelekciós marker (antibiotikum) használatával (katalógusszámok L5667, L0168, L0543, L0418, L8795)
• a kiválasztott E. coli nagyobb léptékűvé tétele megfelelő táptalajokon, például klasszikus LB-változatokban (termékszámok L2542, L3522, L3147) vagy EnPresso™ B növekedési rendszerek (termékszám B11001)
  
• az intracelluláris/szekretált fehérjék izolálása és tisztítása

Jellemzők

• alacsony költségű tenyésztési módszerek
• Flexibilis rendszer - többféle promóterrel, címkével és restrikciós helyekkel ellátott plazmidok hordozására alkalmas
• könnyen skálázható és nagyobb fehérje hozamot eredményezhet

Gombafehérje expressziós rendszerek - Saccharomyces cerevisiae

A magasan fejlett genetikai rendszer, az egyszerű használat, a csökkentett időigény és költségek miatt S. cerevisiae -t a rekombináns fehérjék expressziójának és előállításának vonzó szervezetévé. Az élesztők képesek speciálisan tervezett plazmidok hordozására, és ez a képesség értékes egy rekombináns fehérje-expressziós rendszerben. A felhasznált plazmid olyan restrikciós helyekből áll, amelyek segítségével beilleszthető a kívánt génszekvencia. Az élesztők transzformációja a plazmiddal a kívánt fehérjét eredményezi, és megfelelően növelhető.

3. ábra. Élesztőfehérje-expressziós rendszer - Saccharomyces cerevisiae

A fehérjeexpresszió a S. cerevisiae segítségével a következő lépésekből áll:

• kompetens E. coli sejtek felvétele a kívánt DNS-szekvencia (katalógusszámok CMC0001, CMC0004, CMC0004, CMC0014)
• a DNS beépítése a bakteriális genomba vagy a DNS-szekvencia cirkularizációja, hogy plazmidként létezzen
• a transzformált E. coli  szelekciós marker (antibiotikum) használatával (katalógusszámok L5667, L0168, L0543, L0418, L8795)
• a kiválasztott E. coli megfelelő táptalajokban, például klasszikus LB-változatokban (termékszámok L2542, L3522, L3147) vagy EnPresso™ Y Defined Media (termékszám Y22001)
  
• DNS vagy plazmid izolálása
• transzformáció élesztőbe (élesztő transzformációs készlet, katalógusszám YEAST1)
• a transzformánsok szűrése a DNS élesztő kromoszómába történő integrálódása céljából
• magas expressziós élesztőklónok szelekciója és méretnövelése megfelelő táptalajon (katalógusszámok Y1375, Y1501, Y1501, Y1751, Y2001, Y1376, Y0750)
• intracelluláris/secretált fehérjék izolálása és tisztítása

Jellemzők

• alacsony költségű tenyésztési módszerek
• intracelluláris és szekretált fehérjékhez egyaránt alkalmas
• a fehérjék eukarióta poszttranszlációs glikozilációját biztosítja, bár ez magas

Rovarsejt expressziós rendszerek - Sf9 és Sf21

Az Spodoptera frugiperdából származó sejtvonalakat, Sf9 és Sf21, gyakran használják rekombináns fehérje-expressziós rendszerként. A baculovírus egy litikus, dsDNS vírus, amelyet rutinszerűen a Lepidoptera családba tartozó rovarok sejtjeiben sokszorosítanak. Gerincesekben nem fertőző, promóterei pedig inaktívak az emlős sejtekben.

4. ábra. Rovarsejt-expressziós rendszerek - Sf9 és Sf21

A fehérje expressziója baculovírus/inszektasejtek felhasználásával a következő lépésekből áll:

• kompetens E. coli sejtek felvétele az érdeklődésre számot tartó DNS-szekvenciához (katalógusszámok CMC0001, CMC0004, CMC0014)
• a DNS integrálása a bakteriális genomba vagy a DNS-szekvencia cirkularizációja, hogy plazmidként létezzen
• a transzformált E. coli szelekciós marker (antibiotikum) használatával (katalógusszámok L5667, L0168, L0543, L0418, L8795)
• a kiválasztott E. coli megfelelő táptalajon (katalógusszámok L2542, L3522, L3147)
• DNS vagy plazmid izolálása
• egy második plazmid előállítása, amely a vírusgéneket tartalmazza, amelyek szükségesek a vírusrészecskék szaporodásához és kialakulásához
• az expressziós plazmid és a második plazmid ko-transzfekciója a következőkbe Sf9 vagy Sf21 rovarsejtekbe
• a rekombináns vírusállomány tisztítása
• a vírus amplifikálása és további plakkvizsgálatok a rekombináns vírusállomány titerének növelése érdekében
• a rovarsejtek megfertőzése a magas titerű rekombináns vírusállománnyal
• az intracelluláris/szekretált fehérjék izolálása és tisztítása

Jellemzők

• a rekombináns fehérje nagymértékben expresszálódik a sejtlízis előtti lítikus ciklus utolsó fázisaiban
• megfelelő citoplazmatikus és szekretált fehérjék előállítására egyaránt
• a fehérjékben lévő diszulfidkötések hatékonyan keletkeznek
• az emlőssejtekben található poszttranszlációs módosítások többségét biztosítja

emlőssejt expressziós rendszerek - HEK293 és CHO

Az emlőssejtek rekombináns fehérjék expressziójára történő felhasználásának fő kihívása a kifejezett fehérje csökkent hatékonysága és szintje. Az olyan sejtvonalakat azonban, mint a HEK293 és a CHO, hatékony tranziens, illetve stabil expressziós rendszerként fejlesztették ki. A HEK293 sejtek tranziens transzfekciója liposzómák, kalcium-foszfát vagy PEG transzfekciós reagensek használatával történik. Bár a tranziens expresszió viszonylag könnyű és egyszerű, a méretnövelés technikailag kihívást jelent. A CHO sejteket általában nagy mennyiségű rekombináns fehérje stabil expressziójára használják. Az eljárás során DHFR-hiányos CHO-sejteket transzfektálnak a kívánt génnel és egy DHFR-szelekciós kazettával. A transzfektált sejteket ezután metotrexát jelenlétében szűrni kell, hogy stabilan transzfektált sejtállományokat kapjunk. A szelekciós és expanziós folyamat 2-3 hónapot vesz igénybe

5. ábra. Emlős sejtek expressziós rendszerei - HEK293 és CHO

Az emlőssejtek felhasználásával történő tranziens vagy stabil fehérjeexpresszió a következő lépésekből áll:

• kompetens E. coli sejtek felvétele az érdeklődésre számot tartó DNS-szekvencia (katalógusszámok CMC0001, CMC0004, CMC0014)
• a DNS beépítése a bakteriális genomba vagy a DNS-szekvencia cirkularizációja, hogy plazmidként létezzen
• a transzformált E. coli szelekciós marker (antibiotikum) használatával (katalógusszámok L5667,>L5667,>L5667).nbsp;L0168, L0543., L0418, L8795, L8795/a>)
• >a klónok opcionális tárolása a CloneStable™-ben
• a kiválasztott E. coli megfelelő táptalajokon (katalógusszámok L2542, L3522, L3147)
• DNS vagy plazmid izolálása
• expressziós plazmid transzfekciója emlős sejtekbe az X-tremeGENE™ transzfekciós reagensek használatával.
• stabil klónok kiválasztása
• klónok expanziója tranziens batch-expresszióhoz VAGY klónok expanziója 2-3 hónapig stabil expresszióhoz
/li>
• az intracelluláris/szekretált fehérjék izolálása és tisztítása

Jellemzők

• a tranziens expresszió egyszerű és gyors
• az emlőssejtekben megtalálható összes poszttranszlációs modifikációt biztosítja
• a stabil transzfekció nagyobb hozamot, skálázhatóságot és reprodukálható termelést eredményez

A következő táblázatban összehasonlítjuk a négy fehérjeexpressziós rendszert és azok előnyeit és hátrányait:

Protein expressziós rendszer		Előnyök	Hátrányok
E. coli	gyors expresszió	Nincs eukarióta poszt-transzlációs módosítás
	Kisebb költség	Néhány fehérje nem megfelelően hajtogatott
		Egyszerű folyamat skálázása	A fehérjék ritkán szekretálódnak
Jól jellemezhető genetika
S. cerevisiae	Mértékben gyors expresszió	A fehérjék jellegzetes N-kötésű glikánszerkezete eltér a tipikus emlős fehérjékhez képest
	Jól működik szekretált és intracelluláris fehérjék esetében	Élesztő szekréciós szignálpeptidek használatát igényli
Kisebb költséggel	Kiemelt biztonsági óvintézkedések szükségesek
A legtöbb fehérje hajtogatása és poszt-transzlációs módosítása lehetséges
Baculovírus/rovarsejtek	Mértékben gyors expresszió	A fehérjék jellegzetes N-kötésű glikánszerkezete eltér a tipikus emlős fehérjékhez képest	A fehérjék jellegzetes N-kötésű glikánszerkezete eltér az emlősök fehérjéitől
	Jól működik szekretált, membrán- és intracelluláris fehérjék esetében	Drága
A legtöbb fehérje hajtogatása és poszttranszlációs módosítása lehetséges	Nehéz a méretnövelés
Emlősejtek (tranziens expresszió)	Mértékben gyors expresszió	Drága
	Mérsékelten gyors expresszió	Jól működik szekretált és membránfehérjék esetében	Az intracelluláris fehérjék hozama alacsony
Minden fehérje hajtogatása és a legtöbb hiteles poszttranszlációs módosítás lehetséges	Nehéz a méretnövelés
	Emlősejtek (stabil expresszió)	Minden fehérje hajtogatás és a legtöbb autentikus poszt-transzlációs módosítás lehetséges	drága
Jól működik szekretált és membránfehérjék esetében		Az intracelluláris fehérjék hozamai alacsonyak
	Nehéz a méretnövelés
Hosszú expressziós idő

Válasszon olyan expressziós rendszert, amely a fehérjét az összes kívánatos poszttranszlációs módosítással fejezi ki. A választástól függetlenül kompetens sejtek, rovar- és emlős sejtvonalak és kapcsolódó termékek széles választékát kínáljuk, amelyek bármilyen fehérje-expressziós rendszerhez illeszkednek.