Funkcionalizált polimerek MALDI-TOF jellemzése

Molly E. Payne, Scott M. Grayson

Department of Chemistry, Tulane University, New Orleans, Louisiana

A nagy teljesítményű és speciális polimer anyagok iránti megnövekedett kereslet miatt a szelektív végcsoport-funkcionalizálás és -módosítás eszközei a szintetikus fejlesztések középpontjában állnak. Hangolható fizikai és kémiai tulajdonságaiknak köszönhetően a polimerek számos  anyag¹, biokonjugáció², makromonomerek³ és biomedicinális anyagok⁴ alapvető összetevői.

A komplexitásuk és funkcionális részleteik miatt számos célkomplex (pl, biológiailag aktív anyagok) nem kompatibilisek a polimerizációs körülményekkel. E problémák enyhítésére számos szintetikus módszert fejlesztettek ki a hatékony polimerizáció utáni konjugációra. Például gyakran adnak végcsoportokat a polimerekhez a nagy hatékonyságú kapcsolási reakciókban, mint például az azid-alkin kapcsolás⁵ és a tiol-ének kapcsolás⁶, való felhasználás céljából.

MALDI-TOF MS a polimerek jellemzéséhez

A polimer végcsoport-funkcionalizálás fejlesztésének kritikus korlátja a végcsoportok tisztaságának a módosítás előtti és utáni megerősítésének nehézsége. A modern jellemzési technikák, különösen a mátrix-asszisztált lézer deszorpciós ionizációs ionizációs repülési idejű tömegspektrometria (MALDI-TOF MS) felbecsülhetetlen értékűnek bizonyult a végcsoport-hűség megerősítésében. A MALDI-TOF egy lágy ionizációs technika, amely lehetővé teszi a polimerek egyes n-merei felbontását a tömegspektrum eloszlásában. Ez a felbontás nemcsak a tömegeloszlás és az ismétlődő egység tömegének, hanem a végcsoportok azonosságának és hűségének tisztázását is lehetővé teszi.

Molekulatömeg jellemzése

Viszonylag alacsony diszperzitású polimerek (Đ≤1,3) esetén a MALDI-TOF MS segítségével pontosan meghatározhatók a tömegeloszlási adatok. A molekulatömeg számátlag (M_n) az egyes tömegfrakciók molszámára vonatkoztatott tömegátlag, és a következő képlet segítségével számítható ki:

Mn =	ΣNiMi
	ΣNi

hol N_i = egy adott molekulatömegű molekulák száma és M_i = e molekulák fajlagos molekulatömege

A tömegátlag molekulatömeg (M_w) az egyes tömegfrakciók tömegére vonatkoztatott tömegátlag, és a következő képlettel számítható:

ΣN	SNiMi2
ΣNiMi

hol N_i = egy adott molekulatömegű molekulák száma és M_i = e molekulák fajlagos molekulatömege

A molekulatömeg-eloszlás szélessége vagy diszperzitása (Đ), az M_w/M_n arányával számszerűsíthető.

A végcsoportok jellemzése

A MALDI-TOF MS a polimer molekulatömeg-eloszlásának számszerűsítésére való képességén túlmenően a homopolimer végcsoportok felbontására is használható. Ez úgy érhető el, hogy a tömegspektrumban megfigyelt n-mer tömegére (M_n-mer) a következő képletet állítjuk át:

M_n-mer = n(M_RU) + M<_EG1 + M_EG2 + M_ion ahol n = a polimerizációs fok,

M_EG1 = az α-végcsoport,

M_EG2 = az ω-végcsoport tömege,

M_RU = a polimer ismétlődő egységének tömege

és M_ion = a polimerrel komplexet képző ion tömege.

Kereskedelmi forgalomban kapható anyagok MALDI-TOF karakterizálása

A kereskedelemben számos kész, funkcionalizált polimer áll rendelkezésre biomedicinális alkalmazásokhoz, például PEGiláláshoz, hidrogélszintézishez, célzott hatóanyag-leadáshoz és biokonjugációhoz. MALDI-TOF segítségével ellenőriztük a jelenleg elérhető, nagymértékben meghatározott, funkcionalizált anyagok egy válogatott anyagának diszperzitását és funkcionalitását. Az alábbiakban közölt összes MALDI-TOF spektrum a teljes spektrumot mutatja egy-egy n-mer betétjével. Eredményeink igazolják mind ezen anyagok szűk diszperzitását, mind pedig e kiválasztott anyagok azonosságát és funkcionalizáltsági fokát.

Termék 689696: Poli(etilénglikol) bis-azid (M_n=2000)

1. ábra. A spektrumok vizuális megfigyelése megerősíti, hogy a polimer keskeny, monomodális eloszlású. A polimer molekulatömeg-eloszlását Mn-nek számítottuk: 1940 és Mw: 1950, ami keskeny eloszlást eredményez Đ = 1,01 értékkel. A spektrumon belüli csúcsok egyetlen eloszlásnak felelnek meg, az egyes csúcsokat 44,026 tömegegység választja el egymástól, ami arra utal, hogy ebben a mintában csak egy végcsoport létezik. A végcsoportok ellenőrizhetők az egyes n-merek, például a 41-mer [1b. ábra] vizsgálatával. A két azid végcsoportot tartalmazó 42-mer elméleti tömegértéke 1984,13978, amelyet úgy számoltunk ki, hogy az ismétlődő egységek tömegét (44,02621) megszoroztuk az ismétlődő egységek számával (42), hozzáadtuk az azidó végcsoport tömegét (42,00922), hozzáadtuk az azidoetil végcsoport tömegét (70,04052), és végül hozzáadtuk a nátrium-kation tömegét (22,98922). A 42-mer esetében a megfigyelt érték 1983,95, ami 0,19 Da eltérést jelent az elméleti értéktől.

Termék 747386: Poly(L-laktid), tiolterminált (M_n=2,500)

2. ábra. A spektrumok vizuális megfigyelése megerősíti, hogy a polimer keskeny, monomodális eloszlású. A polimer molekulatömeg-eloszlását a következő értékekre számoltuk: Mn: 2300, Mw: 2350, és Đ =1,02. A spektrumon belüli fő csúcsok egyetlen eloszlásnak felelnek meg, az egyes csúcsokat 72,021 tömegegység választja el egymástól, ami arra utal, hogy ebben a mintában csak egy végcsoport létezik. A végcsoportokat az egyes 26-merek vizsgálatával ellenőriztük [2b. ábra]. A -hidroxi- és ω-tiol végcsoportokkal rendelkező 26-mer elméleti tömegértéke 1973,55254, ami 0,07 Da eltér a megfigyelt 1973,62 Da tömegtől. Ebben az anyagban minden nagyobb csúcs között nagyon kis csúcsok vannak. Ha konkrétan a mellékelt képen megfigyelt kisebb csúcsokat nézzük, a 2045,74-nél lévő csúcs a polimer 27-merjének felel meg, a 2057,73-nál lévő csúcs pedig egy karbonsav végződésű polimernek felel meg (a tiol funkcionalitás helyett). Ezek a kisebb szennyeződések valószínűleg vagy a laktid-monomer gyűrűt nyitó polimerizációjának vízzel történő beindulásából, vagy átészterezésből származnak.

A polimerek konjugációs reakciókat követő MALDI-TOF jellemzése

Míg a polimerek konjugációjának megkönnyítésére számos reakciótípust alkalmaznak, a click-reakciókat széles körben használják egyszerűségük, hatékonyságuk és széles funkciós csoportkompatibilitásuk miatt. A Sharpless és munkatársai által népszerűsített ⁷ rézkatalizált azid-alkin cikloaddíció (CuAAC)⁵ egy alkin reagens egy azid reagenssel konjugál egy 1,2,3-triazol gyűrű kialakításán keresztül. A Bertozzi-csoport kifejlesztette a törzs által támogatott alkin-azid-cikloaddíciót (SPAAC)⁸ egy azid és ciklooktén reagens között, mint rézmentes alternatívát élő sejtekkel és in vivo felhasználásra. A tiool-ének click-reakciók⁶ egy alkén és egy tioolreagens között alkil-szulfid képződéséhez szintén hasznos fémmentes alternatívák, mivel számos alkalmazásban, különösen biológiai alkalmazásokban kompatibilisek. Továbbá, mivel az aminok mindenütt jelen vannak a természetben és a biológiában, a karbonsavak és aminok közötti amidálási reakciók⁹ különösen fontosak a peptidek, fehérjék és konjugátumaik szintézisében.

Míg a click-reakciók magas konverzióval rendelkeznek, a reakció befejezésének megerősítése nehézségekbe ütközhet a polimer konjugációs reakciók esetében.  Az újonnan képződött kötésnek a polimer ismétlődő egységeihez viszonyított alacsony relatív koncentrációja miatt a hagyományos jellemzési módszerek (pl., ¹H NMR) általában nem elég érzékenyek az ellenőrzéshez. Ezzel szemben a MALDI-TOF alkalmazható a végcsoportok felbontására és a reakció befejezésének megerősítésére. Az alábbiakban bemutatott példák két különböző típusú kattintási reakciót mutatnak be, és igazolják, hogy a kívánt vegyület keletkezett. Az egyes reakciókhoz megadott MALDI-TOF spektrumok a fenti kiindulási anyag spektrumát, az alábbiakban pedig a végtermékét mutatják.

Poli(etilénglikol)bisz-azid (689696-os termék) módosítása 1-etil-nil-4-fluorbenzollal CuAAC segítségével

3. ábra. Az azid-alkin-cikloaddícióval (kék) 1-etinil-4-fluorbenzollal módosított polioxietilén-bisz(azid) (Mn=2000) (piros) MALDI-TOF spektrumát mutatja. A spektrumok vizuális megfigyelése megerősíti, hogy a módosítás megtörtént, de ez a kiválasztott n-merek közötti tömegkülönbség alapján is igazolható. Amint a fekete nyíl mutatja, 240,21 Da eltolódás figyelhető meg a kiindulási anyag és a termék között. Ez megfelel a kiindulási anyag 42-merjének (1983,95) és a termék 42-merjének (2224,16) különbségének, és szoros összhangban van az elméleti 240,08 pontos tömegkülönbséggel.

Tiolterminált poli(L-laktid)(747386 termék) 2,5-pirroledionnal történő módosítása tiool-én-klikkreakcióval

4. ábra. MALDI-TOF spektrumok a 2,5-pirroledionnal (zöld) tiol-ének csatolással módosított, tiol végződésű poli(L-laktidról (lila). A teljes spektrum vizuális megfigyelése megerősíti, hogy a kiindulási anyag valamilyen módosításon ment keresztül, de a tiol-ének reakció befejezése az egyes n-merek eltolódásának vizsgálatával igazolható. A fekete nyíllal jelzett 97,02 Da eltolódás figyelhető meg a kiindulási anyag 26-merjéről (1973,55) a 26-meres termékre (2214,56), ami megfelel a tiol-ének reakció után várható tömegeltolódásnak.

Végkövetkeztetés

A polimerek a kereskedelemben különböző molekulatömegekkel, összetételekkel és végcsoport-funkcionalitásokkal kaphatók, és számos alkalmazásban kritikus alkotóelemmé váltak. A megfelelő végcsoporttal a funkcionalizált polimerek gyors és hatékony utat biztosíthatnak a legkülönbözőbb polimer konjugátumok szintéziséhez. Mivel ezen anyagok összetettsége a kutatók igényeinek kielégítése érdekében növekszik, a MALDI-TOF MS értékes eszköz a végcsoport-azonosság és az átalakulások megerősítéséhez, a sikeres és teljes konjugáció ellenőrzéséhez.

Hivatkozások

1. Brinson HF, Brinson LC. 2008. Polymer Engineering Science and Viscoelasticity. https://doi.org/10.1007/978-0-387-73861-1

2. Lutz J, Börner HG. 2008. Modern trends in polymer bioconjugates design. Progress in Polymer Science. 33(1):1-39. https://doi.org/10.1016/j.progpolymsci.2007.07.005

3. Plate N, Valuyev L, Chupov V. 1985. Synthesis and polymerization of macromonomers based on physiologically active compounds. Review. Polymer Science U.S.S.R.. 27(10):2265-2282. https://doi.org/10.1016/0032-3950(85)90302-8

4. Green JJ, Elisseeff JH. 2016. Mimicking biological functionality with polymers for biomedical applications. Nature. 540(7633):386-394. https://doi.org/10.1038/nature21005

5. Meldal M, Tornøe CW. 2008. Cu-Catalyzed Azide?Alkyne Cycloaddition. Chem. Rev.. 108(8):2952-3015. https://doi.org/10.1021/cr0783479

6. Hoyle C, Bowman C. 2010. Thiol-Ene Click Chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 49(9):1540-1573. https://doi.org/10.1002/anie.200903924

7. Rostovtsev V, Fokin V, Sharpless Angew KB. 2002.(41):2596-2599.

8. Baskin JM, Prescher JA, Laughlin ST, Agard NJ, Chang PV, Miller IA, Lo A, Codelli JA, Bertozzi CR. 2007. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104(43):16793-16797. https://doi.org/10.1073/pnas.0707090104

9. Montalbetti CA, Falque V. 2005. Amide bond formation and peptide coupling. Tetrahedron. 61(46):10827-10852. https://doi.org/10.1016/j.tet.2005.08.031