miRNS (mikroRNS) Bevezetés

Bevezetés

A érett mikroRNS-ek (miRNS-ek) a természetben előforduló, kis, nem kódoló RNS-molekulák egy osztálya, körülbelül 21-25 nukleotid hosszúságúak. A mikroRNS-ek részben komplementárisak egy vagy több hírvivő RNS (mRNS) molekulához, és fő funkciójuk a génexpresszió különböző módokon történő szabályozása, beleértve a transzlációs repressziót, az mRNS hasítását és a deadenilációt. Először 1993-ban írta le őket Lee és munkatársai¹, a mikroRNS kifejezést pedig 2001-ben² alkották meg. Azóta több ezer miRNS-t azonosítottak különböző szervezetekben véletlenszerű klónozás és szekvenálás vagy számítógépes előrejelzés révén. A miRBase, amelyet a Sanger Intézet üzemeltet, a miRNS-nómenklatúrával, szekvenciaadatokkal, annotációval és célpont-előrejelzéssel kapcsolatos információkat nyújt.

 miRNS biogenezis

1. ábra. miRNS útvonalak

A miRNS-eket kódoló gének sokkal hosszabbak, mint a feldolgozott érett miRNS-molekula. Számos miRNS-ről ismert, hogy a pre-mRNS-gazdagén intronjaiban található, és közösek a szabályozó elemeik, az elsődleges transzkriptumuk, és hasonló expressziós profillal rendelkeznek. A többi miRNS-gén esetében, amelyek saját promóterükről íródnak át, kevés elsődleges transzkriptumot sikerült teljes mértékben azonosítani. A mikroRNS-eket az RNS-polimeráz II írja át nagy RNS-prekurzorokként, amelyeket pri-miRNS-eknek neveznek, és egy 5' sapkából és egy poly-A farokból³ állnak. A pri-miRNS-eket a sejtmagban a Drosha⁴ RNáz III enzimből⁴ és a Pasha/DGCR8⁵ kettősszálú RNS-kötő fehérjéből álló mikroprocesszor komplex dolgozza fel. Az így keletkező premiRNS-ek körülbelül 70 nukleotid hosszúságúak, és tökéletlen szárhurok szerkezetbe hajtogatódnak. A pre-miRNS-eket ezután a karyopherin exportin 5 (Exp5) és a Ran-GTP komplex⁶ exportálja a citoplazmába. A Ran (ras-related nuclear protein) a RAS szupercsaládba tartozó kis GTP-kötő fehérje, amely nélkülözhetetlen az RNS és a fehérjék transzlokációjához a nukleáris pórus komplexen⁷ keresztül. A Ran GTPáz megköti az Exp5-öt és nukleáris heterotrimert alkot a pre-miRNS-ekkel^6,8. A citoplazmába kerülve a pre-miRNS-ek további feldolgozási lépésen mennek keresztül a Dicer⁹ RNAse III enzim által, amely a miRNS-t, egy kb. 22 nukleotid hosszúságú, kettős szálú RNS-t hoz létre. A Dicer kezdeményezi az RNS-indukált csendesítő komplex (RISC)^{rev. 10} kialakulását is. A RISC felelős a miRNS-expresszió és az RNS-interferencia¹¹ következtében megfigyelhető géncsendesítésért.

Dicer funkciója

A dicerek nagy 200 kDa fehérjék, amelyek tartalmaznak egy ATP-áz/RNS helikázt, egy DUF283 (ismeretlen funkciójú domén) domént, egy PAZ (Piwi, Argonaut és Zwille) domént, amely képes a mi és siRNS jellegzetes két bázisos 3' túlnyúlásait megkötni, két katalitikus RNáz III domént (RIIIa és RIIIb) és egy C-terminális kettősszálú RNS-kötő domént (dsRBD). A Dicer monomerként működik, és egyetlen feldolgozóközponttal rendelkezik, a két RNáz III domén intramolekuláris dimerizációjával. Mindegyik RNáz-domén egymástól függetlenül vágja el a duplex egyik RNS-szálát, hogy 2 nt 3' túlnyúlással rendelkező termékeket hozzon létre. A miRNS-ek premiRNS-ekből történő kivágása mellett a Dicer enzimek a dsRNS-eket siRNS-ekké dolgozzák fel. A Dicer-hasítás után a miRNS-útvonal hasonló az állatokban az RNS-interferencia (RNAi) központi lépéseihez. Az siRNS-ekkel ellentétben a mikroRNS-ek irányíthatják a RISC-t, hogy transzlációs represszióval (a miRNS és az mRNS közötti alacsonyabb komplementaritás alapján) lefelé szabályozzák a génexpressziót, vagy úgy működnek, mint az siRNS-ek, és közvetítik az mRNS hasítását. A poszttranszkripciós mechanizmusok kiválasztását nem a csendesítő RNS (siRNS vagy miRNS) eredete, hanem a komplementaritás mértéke határozza meg. Ha a miRNS tökéletesen vagy közel komplementer a célpontjához, akkor képes specifikusan hasítani a cél mRNS-t. Az endogén módon expresszálódó miRNS-ek általában tökéletlenül komplementárisak a célgén(ek)hez, és a génexpresszióra gyakorolt hatást transzlációs represszión¹² keresztül modulálják.

RISC komplex

Amikor a Dicer hasítja a premiRNS szárhurkot, két komplementer rövid RNS molekula keletkezik, de csak az egyik épül be a RISC komplexbe. A RISC egy ribonukleoprotein komplex, amely az Argonaute (Ago) fehérjecsalád tagjait tartalmazza. Az Argonaute fehérjék endonukleáz aktivitással rendelkeznek, amely a kötött miRNS fragmentumukhoz komplementer mRNS szálak ellen irányul. Az Argonaut részben felelős a vezető szál kiválasztásáért és az utas szál megsemmisítéséért is. A beépített szál az úgynevezett vezető szál, amelyet az argonaute fehérje az 5' végének stabilitása alapján választ ki. A fennmaradó, utas szálnak (*) nevezett szál RISC-komplex szubsztrátként lebomlik. Úgy tűnik, hogy a vezető szál kiválasztása a dsRNS-ből elsősorban a dsRNS két végének stabilitásán alapul¹³. A duplex 5' végén lévő 2-4 nt bázispárosodással rendelkező, alacsonyabb stabilitású szál társul előnyben részesíti a RISC-et, és így lesz az aktív miRNS¹³. Az aktív RISC-komplexbe való integrálódás után a miRNS-ek szabályozó hatásukat azáltal fejtik ki, hogy mRNS-célpontjaik 3' nem transzlált régióiban (UTR) lévő tökéletlen komplementer helyekhez kötődnek. A miRNS kötődéséből eredő kettős szálú RNS kialakulása transzlációs represszióhoz vezet.

miRNS a kutatásban

Bár az első miRNS-t több mint tíz évvel ezelőtt azonosították, a kutatók csak a közelmúltban kezdték megérteni e szabályozó molekulák hatókörét és sokféleségét. Egyre több bizonyíték mutatja, hogy a miRNS-ek a sejtek növekedésével, fejlődésével és differenciálódásával kapcsolatos számos kulcsfontosságú szabályozó funkciót látnak el, és az emberi betegségek széles skálájával hozhatók összefüggésbe. Számos miRNS-t összefüggésbe hoztak a rák^14,15 és a szívbetegségekkel¹⁶. Expresszióelemző vizsgálatok a tumorokban a normális szövetekhez¹⁵ képest perturbált miRNS-expressziót mutatnak ki. A mikroRNS-ek dereguláltak mell-, tüdő- és vastagbélrákban, és felszabályozottak a Burkitt-kórban és más humán B-sejtes limfómákban. Ennek következtében a humán miRNS-ek valószínűleg rendkívül hasznosak lesznek biomarkerekként, különösen a jövőbeli rákdiagnosztikában, és gyorsan vonzó célpontokként jelennek meg a betegségbe való beavatkozásban. A rákhoz való kapcsolatukon kívül a mikroRNS-ek fontos szerepet játszanak a szívműködés és a szívműködési zavarok különböző aspektusainak szabályozásában is. Beleértve a szívizomsejtek növekedését, a kamrafal integritását, a kontraktilitást, a génexpressziót és a szívritmus fenntartását. Kimutatták, hogy a miRNS-ek misexpressziója szükséges és elégséges a szívbetegségek többféle formájához¹⁶.

miRNS-kutatási termékkínálat

Teljesen egyértelmű, hogy a miRNS-kutatás nagy ígéret, és a jövő számos legmodernebb orvosi terápiájának gerincét képezheti. Hogy lépést tartsunk a miRNS iránti növekvő érdeklődéssel, határozottan elköteleztük magunkat a kutatás e gyorsan fejlődő területe mellett, és folyamatban van egy átfogó termékportfólió kifejlesztése ügyfeleink számára, beleértve a miRNS izolálást, amplifikációt, profilalkotást és funkcionális elemzést. A mirPremier microRNS izolációs kit kiegészíti a már eddig is robusztus MISSION^® RNAi termékcsaládot, amely magában foglalja a MISSION^® siRNS, széles választékát;MISSION^® miRNS utánzók és shRNS termékek valamint olyan szolgáltatások, mint könyvtárak, mRNS kimutatási reagensek, antitestek és AQUA™ peptidek a fehérje szintű kimutatáshoz. A támogató reagensek teljes munkafolyamatát, beleértve cellakultúra, sejtbiológiai vegyületek és próbák, transzfekciós reagensek és sok más). 

miRNS-termékek

MISSION^®< Human miRNS Mimics

A Human miRNS Mimics könyvtár a MirBase ver. 21. Könyvtár formátumban (96 lyukú lemez formátumban, 0,25 nmol/lyuk) és egyedi csövekben (5 nmol) kapható. Az új MISSION^® miRNS mimic designt funkcionálisan teszteltük a természetes miRNS célpontokkal szembeni knockdown hatékonysága szempontjából, és csökkenti az esetleges off-target hatásokat.

MISSION^® Target ID Library

A MISSION^® Target ID Library lehetővé teszi a bench-top transzkriptom szintű humán miRNS és ncRNS géncélpontok azonosítását. Az innovatív kettős pozitív szelekciós rendszerrel a teljes transzkriptom teljes miRNS és ncRNS géncélpont szűrését teszi elérhetővé bármely kutató számára, minimális idő-, reagens- vagy tőkeköltséggel.

MISSION^® 3′UTR Lenti GoClone powered by SwitchGear Genomics™

A SwitchGear Genomics^™ vállalattal együttműködve a MISSION^® 3′UTR Lenti GoClone-ok genom-szerte elérhető gyűjteményét kínáljuk. Az új rendszer vírusvektorokat használ a SwitchGear új RenSP riporter génjével fuzionált humán 3′UTR-ek szállítására. A LightSwitch Luciferase Assay Reagent™-eket kifejezetten a RenSP-vel való használatra tervezték, és maximális érzékenységet, dinamikai tartományt és kényelmet biztosítanak.

Hivatkozások

1. Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. 1993. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75(5):843-854. https://doi.org/10.1016/0092-8674(93)90529-y

2. Ruvkun G. 2001. MOLECULAR BIOLOGY: Glimpses of a Tiny RNA World. 294(5543):797-799. https://doi.org/10.1126/science.1066315

3. Lee Y, Kim M, Han J, Yeom K, Lee S, Baek SH, Kim VN. 2004. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23(20):4051-4060. https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7600385

4. Han J. 2004. The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing. Genes & Development. 18(24):3016-3027. https://doi.org/10.1101/gad.1262504

5. Denli AM, Tops BBJ, Plasterk RHA, Ketting RF, Hannon GJ. 2004. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432(7014):231-235. https://doi.org/10.1038/nature03049

6. Yi R. 2003. Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes & Development. 17(24):3011-3016. https://doi.org/10.1101/gad.1158803

7. Moore MS, Blobel G. 1993. The GTP-binding protein Ran/TC4 is required for protein import into the nucleus. Nature. 365(6447):661-663. https://doi.org/10.1038/365661a0

8. Lund E. 2004. Nuclear Export of MicroRNA Precursors. Science. 303(5654):95-98. https://doi.org/10.1126/science.1090599

9. Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. 2001. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409(6818):363-366. https://doi.org/10.1038/35053110

10. Hammond SM. 2005. Dicing and slicing. 579(26):5822-5829. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2005.08.079

11. Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ. 2000. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature. 404(6775):293-296. https://doi.org/10.1038/35005107

12. Filipowicz W, Jaskiewicz L, Kolb FA, Pillai RS. 2005. Post-transcriptional gene silencing by siRNAs and miRNAs. Current Opinion in Structural Biology. 15(3):331-341. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2005.05.006

13. Schwarz DS, Hutvágner G, Du T, Xu Z, Aronin N, Zamore PD. 2003. Asymmetry in the Assembly of the RNAi Enzyme Complex. Cell. 115(2):199-208. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(03)00759-1

14. Croce CM. 2008. Oncogenes and Cancer. N Engl J Med. 358(5):502-511. https://doi.org/10.1056/nejmra072367

15. van Rooij E, Olson EN. 2007. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. J. Clin. Invest.. 117(9):2369-2376. https://doi.org/10.1172/jci33099