Foszforotioát oligonukleotidok

Egy sor foszfátgerinc-változatot fejlesztettek ki annak érdekében, hogy megváltoztassák a natív állapotú DNS kémiai tulajdonságait, és ezáltal leküzdjék az oligonukleotidok in vivo felhasználásával kapcsolatos két fő kihívást, többek között: Ez egyrészt a sejt belsejébe való eljuttatás a plazmamembránon keresztül, amely egy lipid kettősréteg, amely transzportfehérjék nélkül többnyire átjárhatatlan a poláris molekulák számára, másrészt a hatékony molekuláris élettartam meghosszabbítása az extra- és intracelluláris nukleáz lebontás minimalizálásával.

Az egyik eredeti és ma is legszélesebb körben használt gerincváltozat a foszforotioát, amelyet általában S-oligóként emlegetnek, ha oligonukleotidba épül (1. ábra). A foszforotioátról megállapították, hogy segít enyhíteni az oligonukleotidok in vivo alkalmazásával kapcsolatos második fő kihívást azáltal, hogy csökkenti a különböző extra- és intracelluláris nukleázok¹ aktivitását.

1. ábra. Foszfodiészter és foszforotioát internukleotid kötések. A natív állapotú DNS-oligonukleotidok cukorrészletei foszfáton keresztül kapcsolódnak (nem áthidaló oxigént tartalmaznak, kék nyíllal kiemelve), míg a kénező reagenssel módosított oligonukleotidok cukorrészletei foszforotioáton keresztül kapcsolódnak (nem áthidaló ként tartalmaznak, piros nyíllal kiemelve).

Ezek a tulajdonságok teszik a foszforotioátot hatékonnyá az antisense knockdown-okhoz használt oligonukleotidok létrehozásában, amely az egyik korai és még mindig üldözött nukleinsav-terápiás technológia². A foszforotioát oligonukleotidok a génexpressziót a célmRNS-hez hibridizálódva szabályozzák le, ami viszont vagy gátolja az mRNS érését, vagy lehetővé teszi a transzkript RNáz H által közvetített lebontását, vagy blokkolja a transzlációt³.

A in vivo technológiák mellett, mint például az antisense, a foszforotioátot ma már gyakran használják in vitro technológiáknál is hasonló okokból, azaz a nukleolitikus degradáció megakadályozására. Példaként az újgenerációs szekvenálási adapter oligonukleotidokat gyakran módosítják egy 3'-végső internukleotidkötésnél, hogy megakadályozzák a könyvtárkészítés során használt enzimek általi lebontást⁴.

Fizikai tulajdonságok

Míg a foszforotioát belső nukleotidkötések ellenállnak a nukleázoknak, túl sok ilyen kötés bevezetése csökkenti az oligonukleotid funkcióját, különösen az antisense esetében. Ennek oka, hogy a szintézis során alkalmazott kénezési eljárás sztereogén α-foszforatomokat hoz létre (2. ábra), ami diasztereomereket eredményez (2ⁿ-1 konfiguráció egy n hosszúságú oligonukleotid esetében). Az ilyen típusú sztereoizomerek különböző funkcionális tulajdonságokkal rendelkeznek, amelyek közül néhány negatívan befolyásolja az antiszenzációt. A diasztereomerek potenciális negatív hatása azonban minimalizálható a módosítás megfelelő beépítésével.

2. ábra. Sztereogén α-foszfor egy internukleotidkötésnél. A véletlenszerű R és S konfiguráció diasztereomereket eredményez.

Beépítési irányelvek

Mivel a belső nukleotidkötések módosításának hatása gyakran kiszámíthatatlan³, a lebomlásnak ellenálló, hatékony foszforotioát oligonukleotidok tervezése gyakran próbálgatással és hibával történik (3. ábra egy példaszekvenciaformátum). A foszforotioát kötéseknek nem feltétlenül kell az oligonukleotid egészén jelen lenniük, de a következőket figyelembe kell venni:

        •  To resist exonucleases, the oligonucleotide should have phosphorothioate linkages near both the 5' and 3' ends
          -  Az endonukleázoknak való ellenállás érdekében az oligonukleotidnak a szekvencia teljes hosszában foszforotioát kötésekkel kell rendelkeznie

A beépítések minimális számát - tipikusan kísérleti úton meghatározott - kell alkalmazni a diasztereomer keverékkel járó negatív hatások elkerülése érdekében, többek között: 1) interferencia az oligonukleotiddal:az alacsonyabb olvadási hőmérséklet (T_m) által előidézett célhibridizáció termodinamikája - bizonyos konfigurációk sztérikus akadályozásából ered, ami növeli a molekula merevségét, és 2) a célon kívüli kötődés - a túlzott foszforotioátkötések "ragadósakká" tehetik az oligonukleotidokat - hamis antisense-hatásokhoz vezethet, és így növeli a sejttoxicitás valószínűségét.
 

                                                  ACGTACGTACGTACGTACTACGT                    A*C*G*TACGTACGTACGTA*C*G*T

                                           Foszfodiészter oligonukleotid                    Foszforotioát oligonukleotid

3. ábra. Foszfodiészter és foszforotioát oligonukleotidok azonos szekvenciájú rövidített szekvenciaformátumainak példái. A foszforotioát internukleotid kötéseket csillaggal jelöljük. Amint látható, a szekvencia minimális számú beépítéssel rendelkezik, és egy hipotetikus exonukleázzal szembeni védelemre szolgál.

Azt is figyelembe kell venni, hogy a módosításokkal ellátott foszforotioát oligonukleotidok igénylése esetén a reakció sztöchiometriája csökkenhet, ami viszont alacsonyabb minimális hozamot eredményez, mint a csak foszforotioát oligonukleotidoké ( Standard DNS-szintézis és Custom DNA Oligos Modifications a csak foszforotioátos és módosított foszforotioátos oligonukleotidok minimális hozamához).

Tisztítás

A foszforotioát oligonukleotidok HPLC-vel tisztíthatók, ami azért előnyös, mert gyakran in vivo használják őket, és ezért a lehető legnagyobb homogenitásúnak kell lenniük a citotoxikus hatások, célponton kívüli kötődés stb. elkerülése érdekében. A HPLC-csúcsok azonban valamivel szélesebbek lesznek, mint a foszfodiészter oligonukleotidoké, mivel a foszforotioát oligonukleotidok hajlamosabbak másodlagos szerkezetek kialakítására, valamint arra, hogy diasztereomer keverékből állnak (Chromatography Profile Analysis of Phosphorothioate Oligonucleotides).

Conclusion

A foszforotioát hatékonyan csökkenti az in vivo és in vitro technológiákhoz szükséges oligonukleotidok nukleolitikus degradációját. Többféle szintézisskála és tisztítás áll rendelkezésre a különböző kutatási és alkalmazott igények kielégítésére. 

Hivatkozások

1. Putney SD, Benkovic SJ, Schimmel PR. 1981. A DNA fragment with an alpha-phosphorothioate nucleotide at one end is asymmetrically blocked from digestion by exonuclease III and can be replicated in vivo.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 78(12):7350-7354. https://doi.org/10.1073/pnas.78.12.7350

2. Eckstein F. 2014. Phosphorothioates, Essential Components of Therapeutic Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 24(6):374-387. https://doi.org/10.1089/nat.2014.0506

3. Chan JH, Lim S, Wong WF. 2006. ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES: FROM DESIGN TO THERAPEUTIC APPLICATION. Clin Exp Pharmacol Physiol. 33(5-6):533-540. https://doi.org/10.1111/j.1440-1681.2006.04403.x

4. Shin J, Ming G, Song H. 2014. Decoding neural transcriptomes and epigenomes via high-throughput sequencing. Nat Neurosci. 17(11):1463-1475. https://doi.org/10.1038/nn.3814