Sikeres transzdukció lentivírus használatával

Módszerek és tippek a lentivírus termékek sikeres használatához.

A sikeres célzott kezelés a folyamat kulcsfontosságú érzékeny lépéseinek optimalizálásán alapul, beleértve a lentivirális transzdukciót is. Az alábbiakban néhány hasznos kezelési és titrálási tippet olvashat a K+F;D lentivírus szakértőinktől. Mint mindig, ha bármilyen kérdése van a genommódosítási projektjével kapcsolatban, forduljon műszaki támogatásunkhoz a CRISPR@sial.com címen.

• A lentivírus transzdukciós protokoll áttekintése
   

A kulcsfogalmak meghatározása:

MOI - Multiplicity Of Infection - A transzdukáló lentivírus részecskék számának és a sejtek számának aránya.
VP - Vírusrészecske - a vírus extracelluláris fertőző formája, amely egy fehérjeburokban lévő RNS vagy DNS magból áll
TU - Transzdukáló egység - az oldatban lévő funkcionális vírusrészecskék száma, amelyek képesek egy sejtet transzdukálni és a transzgént kifejezni

 

Lentivírusok kezelése:

• A lentivírusok érzékenyek a szélsőséges hőmérsékletváltozásokra. A többszöri fagyasztási-olvasztási ciklusok és a környezeti hőmérsékletnek való tartós kitettség csökkenti a funkcionális lentivírus titerét.
  
  
  
• A lentivírus részecskéket nedves jégen olvassa fel. A lentivirális transzdukciók elvégzése közben tartsa őket jégen.
  
  
  
• A lentivírust az első felolvasztáskor kisebb munkatérfogatokba kell aliquotálni.  Az eredeti kísérletben fel nem használt aliquotokat azonnal vigye vissza -70 °C-ra.  Alternatív megoldásként rendelje meg a lentivírust munkamennyiség aliquotokban, és csak azokat a mennyiségeket olvassa ki, amelyekre a transzdukciókhoz szüksége lesz.
  
  
  
• A vírust és minden olyan technikai eszközt és tippet, amely vírussal vagy vírust tartalmazó sejtekkel érintkezik, 20 percig áztassa 10%-os fehérítőszerben, mielőtt a biológiailag veszélyes hulladékba dobja.

Javaslatok és lépések a kísérlet beállításának optimalizálásához

• Készítsen egy kill-görbét minden egyes sejtvonalra, amelyet használni fog, hogy meghatározza a lentivírusba integrált sejtek szelektálásához szükséges optimális antibiotikum-koncentrációt
  
  
  
  /li>
• Meghatározza a funkcionális titereket minden egyes használt sejtvonal és lentivirális vektorkombináció esetében (lásd alább)
  
  
• Meghatározza a fertőzés multiplicitását (MOI) minden egyes használt sejtvonal és lentivirális vektorkombináció esetében.  A MOI a transzdukáló lentivirális részecskék számának és a sejtek számának aránya.  Nagyon ajánlott, hogy minden egyes új transzdukálandó sejttípus esetében a MOI tartományt teszteljük.
  
  
  • Tegyen 1,6 x 10⁴ sejteket egy 96 lyukú lemez mélyedéseibe 120 µl friss médiummal.
  • Adjon a sejtekhez kontrollvírust a MOI tartományban. A legtöbb sejttípus esetében a 0,1 - 10 MOI tartomány megfelelő. A nehezen transzfektálható sejtvonalak esetében szükség lehet a tartomány 50 vagy 100 MOI-ra való növelésére.
  • Az antibiotikumos szelekció alkalmazása esetén: alkalmazzon szelekciós tápfolyadékot, és azonosítsa az életképes sejteket tartalmazó kutakat a legalacsonyabb vizsgált MOI-értéknél. Ez az a MOI, amelyet a jövőbeni transzdukciós kísérleteiben erre a sejtvonalra és vektorra használjon
  • Fluoreszcencia használata esetén: azonosítsa a kívánt számszerűsíthető fluorofór-expresszióval rendelkező kutat a legalacsonyabb tesztelt MOI-értéknél.
     
• A MOI megállapítása után szükséges vírusmennyiség kiszámításához:
  • (az edényenkénti vagy kútonkénti összes sejtek száma) x (kívánt MOI) = a szükséges összes TU
    
  • (a szükséges összes TU) / (TU/mL funkcionális titer) = az egyes kutakhoz adandó összes mL lentivírus részecske
    
  /li>

Lentivírus részecskék titrálása:

A lentivírus készítmény elkészülte után, a transzdukció előtt meg kell határozni a titerét. A lentivirális termékeinkről bejelentett vírustitereket p24 ELISA módszerrel határozzuk meg. Ez a teszt a lentivírushoz kapcsolódó p24 kapszidfehérjét méri.

• A TU/mL-t a ZeptoMetrix p24 tesztje alapján határozzuk meg. A pg/mL p24 és a vírustiter közötti összefüggés meghatározásához a Didier Trono -tól származó átváltást használjuk:
  
  
• Ismert változók:
  1. A lentivírus p24 fehérjéből / fizikai részecske (PP) körülbelül 2000 molekula van.
  2. 1 Da = 1 g/mol
  3. Avogadro száma = 6 x 10²³ molekula/mol
  4. A p24 fehérje molekulatömege 24 x 10³ Da = 24 x 10³ g/mol
  
  
• Egylet:
  (2000 molekula/PP) ● (24 x 10³ g/mol)= 48 x 10⁶ g ● molekula / PP ● mol
  
  (48 x 10⁶ g ● molekula / PP ● mol) ÷ (Avogadro száma) =
  (48 x 10⁶ g ● molekula / PP ● mol) ÷ (6 x 10²³ molekula/mol) = 8 x 10^-17 g/PP
  
  Kerekítéssel 8 x 10^-17 g/PP ≃ 1 x 10^-16 g/PP
  
  
  A g/PP-t alakítsuk át pg/PP-re: (1 x 10^-16 g/PP) ● (1 x 10¹² pg/g) = 1 x 10^-4 pg/PP
  
  Megtaláljuk az inverzét:
  Ha 1 x 10^-4 pg = 1 PP; az inverze: 1 pg = 1 x 10⁴ PP
  
  
  Ezért 1 pg p24 fehérje körülbelül 10.000 PP
  tartalmaz./li>

A transzportkonstrukció, más néven transzfervektor lentivirális részecskékbe való csomagolásának hatékonysága nagymértékben változhat a transzfervektor méretétől és összetételétől függően.  Így egy ésszerűen jól csomagolt, VSV-G pszeudotípusú lentivirális vektor fertőzőképessége a nem hatékony transzfervektorok esetében 1 TU per 200 vírusrészecske és 1 TU per 1 vírusrészecske között mozog, ha 100%-os hatékonyságú víruscsomagolás történik. Fontos megjegyezni, hogy a rekombináns lentivírus funkcionális titerének mérése nemcsak attól függ, hogy a transzfervektor csomagolása mennyire hatékony, hanem a használt sejtvonal transzdukciós hatékonyságától is.

• Az egyedi és a készleten lévő lentivírus-készítményeket analitikai tanúsítvánnyal (C of A) látjuk el, amely a p24 titerét transzdukáló egység/mL-ben (TU/mL) adja meg.
  
  
• A 96 lyukú formátumban (kis méretben) történő előállítás esetén a lenti vektorainkat úgy jellemezték, hogy 1x10⁶ és 1x10⁷ TU/mL közötti eredményt adnak (p24 ELISA-val mérve).
  
  
  
• Magasabb titerek és mennyiségek (nagyméretű) állnak rendelkezésre. A rendelkezésre álló titerek 1x10⁷ és 1x10¹⁰ TU/mL között mozognak (a p24 ELISA-val mérve), a térfogati lehetőségek pedig 0,1 ml és 10 ml között mozognak. Megjegyzés: nem minden térfogatopció áll rendelkezésre a legmagasabb titerekben.
  
  
• A p24 és a funkcionális titer közötti korreláció vektor- és sejtvonal-specifikus. Minden egyes transzdukciós kísérlet elején először határozza meg a p24 titer és a funkcionális titer közötti kapcsolatot az egyes vektorok esetében a használni kívánt sejtvonalon. A funkcionális titer meghatározásának általános módszerei a következők:
  • A kolóniaalkotó egységek létrehozására szolgáló határhígítási protokoll (CFU-teszt)
  • Fluoreszcencia-aktivált sejtválogatás (FACS) titrálás
  • qRT-PCR
  • Visit Lentivírus protokollok oldalon a részletekért
     
• Kínálunk számos, a kísérleti beállítások optimalizálására és a p24 titer és a funkcionális titer közötti kapcsolat meghatározására tervezett készleten kívüli és egyedi kontrollt. Miután a p24 és a funkcionális titer közötti korrelációt az egyes sejtvonal(ak) és vektor(ok) esetében meghatároztuk, ugyanez a korreláció használható a fennmaradó kísérletekben ugyanazzal a vektorral és sejtvonallal.