Cisztein-tartalmú peptidek Fmoc SPPS-ének protokolljai

A Cys-t tartalmazó peptidek létezhetnek redukált (szulfhidril) vagy oxidált, láncközi/láncközi diszulfidkötésű formában. A Cys-t tartalmazó peptidek szintézise ezért különleges kihívások elé állítja a peptidkémikusokat. A szintetikus stratégia gondos megtervezése elengedhetetlen, ha a megfelelő szerkezetű peptidet jó hozammal akarjuk előállítani. A legmegfelelőbb szulfhidril-védőcsoport kiválasztása kiemelkedő jelentőségű, mivel egy "rossz" választás leküzdhetetlen nehézségeket okozhat a szintézis vagy a későbbi diszulfidkötés kialakulása során.

Nem szabad elfelejteni, hogy az itt leírt eljárások csak kiindulópontot jelentenek, és nem garantálható, hogy minden esetben működnek. A problémák szekvenciafüggőek, és gyakran a reakciókörülmények jelentős optimalizálására van szükség. Ha mégis nehézségek merülnek fel, a műszaki szolgálatunk lehetőség szerint szívesen segít Önnek. A cisztein-tartalmú peptidek kezelésével kapcsolatos megbeszéléseket, valamint a részletes gyakorlati protokollokat lásd a hivatkozásban.¹

Ciszteinil védelem

A ciszteinilvédő csoportok széles választéka áll rendelkezésre az Fmoc SPPS (szilárd fázisú peptidszintézis) során történő felhasználásra. A választás a kívánt peptid jellegétől és a szintetikus stratégiai jellegétől függ. Az Fmoc SPPS-ben általánosan használt tiolvédő csoportok összefoglalása (1. táblázat).

A szabad tiolcsoportokat tartalmazó ciszteinil peptidek rutinszintéziséhez különösen ajánlott a tritilcsoport, mivel az labilis a TFA-val (trifluor-ecetsavval) szemben, ezért a szokásos hasítási eljárás során eltávolításra kerül. A peptidet kezdetben redukált monomer formában kapjuk, de ha szükséges, oxidációval könnyen átalakítható dimer vagy ciklikus diszulfidkötésű formává.

A tioolcsoportok szelektív módosítására vagy a gyantán belüli diszulfidképzésre az STmp és az Mmt a leghasznosabb, mivel ezek az Fmoc SPPS-ben alkalmazott standard oldalláncvédő csoportokkal ellentétes feltételek mellett eltávolíthatók.

A védőcsoportok kiválasztása a szelektív diszulfidképzéshez kevésbé egyszerű, és az optimális kombináció megtalálása kiterjedt kísérletezést igényelhet. Az alábbiakban részletesen tárgyaljuk ezt a kérdést, Diszulfidkötés kialakulása védett ciszteinilpeptidek oxidációjával.

.

1. táblázat.

Védőcsoport	Klávírozó reagens	Klávírozó reagens	Kommentárok
Acetamidometil(Acm)	Hg2+, Ag+, I2, Tl.3+, RSCl, PhSOPh-CH3SiCl3	TFA-val szemben stabil. Lehetővé teszi a peptid védett formában történő tisztítását a könnyen oxidálható tiolcsoportok felszabadulása előtt. Az Acm eltávolítása és az egyidejű diszulfidkötés kialakulása I2 vagy Tl3
t-Butil(tBu)	Hg(II), HF(20 oC), TFA/DMSO, PhSOPh-CH3SiCl3	TFA és jód oxidációval szemben stabil. A MeSiCl3/PhSOPh-val történő kezelés eltávolítja a t-Bu-t és egy lépésben ciklizálódik anélkül, hogy a meglévő diszulfidkötéseket megzavarná. A DPDS-sel savban történő kezelés a meglévő diszulfidhidak és a Cys(Acm) jelenlétében közvetlenül Cys(Pys) képződéséhez vezet.
Trityl(Trt)	Hg2+, Ag+, I2, Tl3+., TFA, I2, Tl3+	Hasznos származék az Fmoc SPPS rutinszerű használatához, mivel közvetlenül a TFA hasadási reakcióból hozza létre a szulfhidril peptidet.
Difenilmetil(Dpm)	Hg2+, Ag+, I2, Tl3+, TFA, I2, Tl3+	Hasznos származék az Fmoc SPPS rutinszerű használatához, mivel közvetlenül a TFA hasadási reakcióból hozza létre a szulfhidril peptidet. Használható Mmt-csoporttal kombinálva, mivel a Dpm nem vérzik el az Mmt 2%-os TFA-val történő eltávolítása során.
Tetrahidropiranil (Thp)	Hg2+, Ag+, I2, Tl3+, TFA, I2, Tl3+	Hasznos származék az Fmoc SPPS rutinszerű használatához, mivel közvetlenül a TFA hasadási reakcióból hozza létre a szulfhidril peptidet. A Trt csoport alternatívája. Használata kevesebb racemizációt és b-eliminációt eredményez, mint a Trt.
t-butiltio(StBu)	RSH, R3P	TFA-val szemben stabil, feltéve, hogy nem használnak tiol-radírokat. Acm-mel kombinálva két diszulfidkötés szelektív kialakítására használták. Az eltávolítás azonban lassú, és az STmp-t előnyben részesítik a gyantán történő védtelenítéshez.
Trimetoxi-fenil-tio(STmp)	RSH, R3P		TFA-val szemben mérsékelten stabil, feltéve, hogy nem használnak tiol-leválasztókat. Mmt-vel kombinálva használták két diszulfidkötés szelektív, gyantán történő kialakítására.
4-metoxitritil(Mmt)	2% TFA DCM-ben, Hg2+, Ag+</sup>, I2, Tl3+,	Szelektíven eltávolítható, miközben a peptid a szilárd fázishoz kötve marad. Ideális a gyantán belüli diszulfidkötés kialakításához vagy a Cys oldallánc módosításához.
3-Nitro-2-piridinszulfenil(Npys)	RSH, R3P	TFA-val szemben stabil, feltéve, hogy nem használnak tiol-radírokat. Aktiválja a tiolcsoportokat a diszulfidkötés kialakulása felé. Hasznos vegyes diszulfidok szelektív előállítására.

Fmoc SPPS védett ciszteinszármazékokat használva

A többi Fmoc-védett aminosavval ellentétben az Fmoc-védett Cys-származékok a standard kapcsolási reakciók során jelentős racemizáción mehetnek keresztül. A probléma különösen akkor jelentkezik, amikor bázisok által közvetített módszereket, mint például a HBTU/DIPEA-t használnak a karboxilaktiváláshoz. A mikrohullámú fűtés és az előaktiválás súlyosbítja a problémát. Szerencsére a racemizáció elhanyagolható, ha a csatolást savas/semleges körülmények között végezzük, előformált szimmetrikus anhidridek² vagy OPfp észterek³ vagy DIPCDI/HOBt vagy DIPCDI/Oxyma aktiválással.

A peptidsav szintézise, amely egy Cvégső ciszteinmaradékot tartalmaz, különös figyelmet igényel, mivel a kiterjedt epimerizációsup>4 és β-piperidinilalanin képződés⁵ fordulhat elő a lánchosszabbítás során. Ezek a mellékreakciók ott a legproblémásabbak, ahol a ciszteinmaradékot Wang-típusú gyantához rögzítik. Szerencsére a tritil-típusú gyanták⁶ mint a 2-klórtritil gyanta, NovaSyn TGT, NovaPEG Trityl gyanták használata úgy tűnik, hogy ezeket a problémákat elfogadható szintre csökkenti, és erősen ajánlott a Cvégső ciszteint tartalmazó peptidsavak szintéziséhez.

Ciszteinil-peptidek szintézise

Cys(Trt), Cys(Thp) és Cys(Dpm)

A szabad szulfhidrilcsoportokat tartalmazó peptidek szintéziséhez az Fmoc-Cys(Trt)-OH használata a legköltséghatékonyabb megközelítés. A tritilcsoport a TFA-val szemben labilis, ezért a hasítási reakció normál menete során eltávolításra kerül.

A tritil-kation nagy stabilitása és a tiolcsoport erősen nukleofil jellege miatt ez a reakció reverzibilis, ezért a teljes védtelenítés biztosítása érdekében különös figyelmet kell fordítani a hasítási körülményekre. A Cys(Trt)-maradványok nem teljes védtelenítésével kapcsolatos problémák általában TIS^7a-t tartalmazó hasító koktélok alkalmazásával áthidalhatók. Ez a reagens rendkívül hatásos a tritil-kation kioltásában, és visszafordíthatatlanul trifenilmetánná alakítja azt. Helyettesíthető trietilszilánnal, bár a nem védett triptofánt tartalmazó peptideknél óvatosan kell eljárni, mivel a szilánok köztudottan az indolok redukcióját okozzák.

A több Cys(Trt)-maradékot tartalmazó peptideknél a legjobb eredményt akkor kapjuk, ha a peptidet közvetlenül dietil-éterbe csapoljuk ki a TFA hasítóelegyből. A hasító koktélhoz 2,5 % etanoldithiol hozzáadása segít biztosítani, hogy a peptid redukált állapotban maradjon, és minimalizálja a cisztein-tiolcsoport alkilezéséből származó melléktermékeket. Lényeges, hogy a hasító koktélt a hasított peptidmennyiségnek megfelelő mennyiségben használjuk. Általában 0,5 mmolonként 30 ml elegendő. (kb. 16 ekv. EDT/Cys-maradék) Ha azonban a peptid több Cys-maradékot és sok t-butil védőcsoportot tartalmaz, az EDT koncentrációját vagy a használt koktél mennyiségét növelni kell a hatékony tisztítás érdekében.

A közelmúltban bevezették az Fmoc-Cys(Thp)-OH-t az Fmoc-Cys(Trt)-OH alternatívájaként, ahol a szulfhidrilcsoportot a savval lebontható tetrahidropiranil (Thp) csoporttal^7b védik. Az Fmoc-Cys(Thp)-OH alkalmazása a megfelelő S-Trt, S-Dpm, S-Acm és S-StBu származékoknál jobb eredményt ad. A Wang-gyantákhoz kötött C-terminális ciszteinmaradványok esetében jelentősen alacsonyabb racemizációt és -piperidinilalanin képződést figyeltek meg a hosszan tartó piperidinkezelések során. Az Fmoc-Cys(Thp)-OH DIPCDI/Oxyma Pure kapcsolása során a racemizáció mindössze 0,74% volt, szemben az Fmoc-Cys(Trt)-OH (3,3%) és az Fmoc-Cys(Dpm)-OH (6,8%) értékekkel. A Thp csoport teljes eltávolítása TFA/víz/TIS 95:2,5:2,5:2,5 TFA/víz/TIS 95:2,5:2,5 kezeléssel történt 2 óra alatt. A Thp-csoport azonban stabil 1%-os TFA-val szemben DCM-ben, ami megkönnyíti a védett peptidfragmentek szintézisét hipersav-labilis gyantákon, mint például a 2-klórtritil vagy HMPB gyantákon.  A kezdeti bizonyítékok arra utalnak, hogy az S-Thp peptidek jobb oldhatósággal rendelkeznek a Trt-vel védett peptidekhez képest.

A Fmoc-Cys(Dpm)-OH értékes alternatívája az Fmoc-Cys(Trt)-OH-nak a Cys-maradékok bevezetésére az Fmoc SPPS^7c során. Két diszulfidhidat tartalmazó ciklikus peptidek regioszelektív szintézise könnyen megvalósítható a Dpm és Mmt szulfhidril védőcsoportok kombinációjával. Az S-Dpm védelem 1-3%-os TFA-val szemben stabil, ellentétben az S-Trt-vel, amely lassan hasad, de 95%-os TFA-val eltávolítható. Ezek a tulajdonságok lehetővé teszik az S-Mmt csoportok eltávolítását híg TFA-val a szilárd fázisban az S-Dpm csoportok elvesztése nélkül. A szabad szulfhidrilek ezután oxidálhatók az első diszulfidhíd kialakításához. Az ezt követő TFA/DMSO/anizol koktéllal történő kezelés egy lépésben leválasztja a peptidet a gyantáról, eltávolítja az S-Dpm csoportokat és a második diszulfidhíd kialakulását eredményezi."

Cys(Acm) és Cys(tBu)

Acm és tBu védelem is használható ciszteinil peptid előállítására. Ez a módszer azonban már nem általános használatban van.

Az Acm és t-butilcsoportok stabilak az összes többi oldalláncvédő csoport eltávolításához szükséges körülmények között. Ezért a peptid köztes tisztítása lehetséges e ciszteinvédő csoportok leválasztása előtt. E védőcsoportok eltávolítása higany(II)-acetáttal vagy ezüst-trifluor-metánszulfonáttal történő kezeléssel érhető el. Az utóbbi esetben a ciszteinilpeptid ezüstsójának aq. HCl-DMSO-val történő kezelése közvetlen diszulfidkötés kialakulásához vezet⁸.

FIGYELEM: A higany és az ezüstsók mérgezőek és maró hatásúak; nagy körültekintéssel kell eljárni e reagensek használata során.  Megfelelő szemvédelem, laboratóriumi köpeny és kesztyű viselése kötelező.  Kövesse a helyi, állami/tartományi és szövetségi biztonsági előírásokat. Használja hatékony füstgázszekrényben.

1. módszer: Acm-védett peptidek Hg(II)⁹

A kényelem érdekében ezeket a reakciókat centrifugacsőben is el lehet végezni.

1. Az (Acm) peptidet feloldjuk 10%-os aq. AcOH-ban (5-10 mg/ml), és állítsuk be az oldat pH-ját nagyon óvatosan 4,0-ra jéghideg AcOH-val.
2. Adjunk hozzá higany(II)acetátot (10 ekv./Acm), és állítsuk újra 4,0-ra a pH-t AcOH-val vagy aq. NH₃-val. Az elegyet szobahőmérsékleten, N₂ takaró alatt óvatosan keverjük meg.
3. Adjunk hozzá β-merkaptoetanolt (20 ekv./Acm), és hagyjuk az elegyet 5 órán át állni.
4. A csapadékot centrifugálással távolítsuk el, és a felülúszót HPLC-vel sótalanítsuk.

2. módszer: A t-butil-védett peptidek Hg(II)¹⁰

1. Oldjuk fel a (tBu) peptidet jéghideg TFA-ban (5-10 mg/ml).
2. A kapott oldathoz adjunk higany(II)-acetátot (10 ekv./tBu), és keverjük az elegyet óvatosan szobahőmérsékleten 3 órán át N₂ takaró alatt.
3. A TFA-t csökkentett nyomáson, szobahőmérsékleten történő bepárlással távolítsuk el, és a maradékot oldjuk fel újra 10%-os vizes ecetsavban.
4. Adjunk hozzá β-merkaptoetanolt (20 ekv./tBu), és hagyjuk az elegyet 5 órán át állni.
5. A csapadékot centrifugálással távolítsuk el, és a felülúszót HPLC-vel sótalanítsuk.

3. módszer: Az Acm csoport eltávolítása Ag(I)¹¹

1. Az (Acm) peptidet TFA/anisol (99:1) (1 mg/ml) oldjuk fel.
2. A kapott oldathoz adjunk ezüst-trifluor-metánszulfonátot (100 ekv./Acm), majd keverjük 4 °C-on 2 órán át.
3. A peptid ezüstsóját éterrel kicsapjuk, és centrifugálással izoláljuk.
4. A peptidet 1 M ecetsavban lévő ditiotreitollal (DTT) (40 ekv./Acm) kezeljük 25 °C-on 3 órán keresztül. Centrifugáljuk és HPLC-vel sótalanítsuk a felülúszót.
5. Kezeljük a peptidet aq. 1M HCl/DMSO-val (1:1) egy éjszakán át szobahőmérsékleten. Szűréssel távolítsuk el az AgCl-t, és HPLC-vel izoláljuk a terméket.

Cys(t-butilthio) és Cys(STmp)

Cys(tButhio)¹² vagy Cys(STmp)¹³ beillesztése. maradékok szekvenciába történő beillesztése lehetővé teszi a tiolcsoport szelektív védtelenítését a szilárd fázisban, ami lehetővé teszi a Cys-maradékok módosítását vagy a gyantán belüli diszulfidhíd kialakítását.

A t-butiltio-csoport stabil a TFA-val szemben, feltéve, hogy a tiolokat nem használják scavengerként a hasítási reakcióban. Ez eltávolítható redukcióval vagy tiolokkal¹² vagy trialkilfoszfinokkal^14,15. Nemrégiben Góngora-Benítez, et al.¹⁶ kimutatta a 20%-os β-merkaptoetanol, 0.1 M NMM DMF-ben a tbutil-tio szilárd fázison történő eltávolítására, ahol a β-merkaptoetanol önmagában vagy a foszfinok sikertelenek voltak.

A gyakorlatban azonban gyakran rendkívül nehéznek bizonyul a tButio-csoport eltávolítása a szilárd hordozón. Ezért Albericio nemrégiben bevezette az STmp csoportot¹³. Úgy tűnik, hogy az STmp csoport rendkívül könnyen eltávolítható enyhe tiolízissel, mivel Albericio négy STmp csoport eltávolításáról számolt be a szilárd fázison, mindössze három 5 perces 0-ás kezeléssel.1 M N-metilmorfolin (NMM) 5% merkaptoetanolt tartalmazó DMF-ben.

4. módszer: Az STmp eltávolítása a gyantán tiolokkal

1. kezeljük a peptidil-gyantát 5%-os β-merkaptoetanollal, O. 1 NMM DMF-ben 5 percig szobahőmérsékleten.
2. Mossuk a gyantát DMF-fel és ismételjük meg a tiolos kezelést még kétszer.

Cys(Mmt)

A Cys(Mmt)-maradványok gyantában történő leválasztása 2% TFA-val DCM-ben szakaszosan vagy folyamatos áramlással végezhető. Az utóbbi esetben a reakció spektrofotometriásan nyomon követhető a tritil-kation felszabadulásának követésével 460 nm-en. A szakaszos szintézis esetén a reakcióhoz trityl-leválasztót, például TIS-t vagy TES-t lehet hozzáadni a hasadás fokozása érdekében. A tritil-kation által biztosított színjelzés azonban elveszik.

A reakciót ideális esetben lezárt szinterezett üvegtölcsérben kell elvégezni, hogy megakadályozzuk a nagy illékonyságú DCM elpárolgását, és a szűrési reakciót vákuum helyett N₂ nyomás alkalmazásával kell elvégezni.

5. módszer: Az Mmt eltávolítása 2%-os TFA-val DCM-ben.

Tételes módszer:

1. A száraz gyantát (1 g) DCM-mel egy szinterezett üvegtölcsérben (csapos és dugóval ellátott típus) előkeverjük.  Távolítsuk el a felesleges DCM-et.
2. Adjunk hozzá 94:1:5 DCM/TFA/TIS (10 ml), zárjuk le a tölcsért és rázzuk 2 percig. Távolítsa el az oldószert N₂ nyomás alkalmazásával.
3. Ismételje meg a 2. lépést ötször.
4. Mossa le a gyantát DCM-mel és szárítsa meg vákuumban.

Áramlási módszer:

1. A gyantát (1 g) előáztassuk DCM-mel, és pakoljuk a reakcióoszlopba.
2. Pumpáljunk 1%-os TFA-t DCM-ben (2 ml/perc) a gyantán keresztül. A reakciót az oszlop eluensének abszorbanciájának mérésével lehet követni egy 0,1 mm-es áramlási cella segítségével 460 nm^a-nél.
3. Amikor a reakció befejeződött, amit az abszorbancia alapvonalra való visszatérése jelez, öblítse át az oszlopot DCM-mel.
   ^aHa a peptid más tritil alapú védőcsoportokat tartalmaz, a szint a Trt-csoportok lassú kioldódása miatt nem tér vissza az alapértékre.

A gyakorlatban az Mmt-csoport teljes eltávolítása nehéz lehet, különösen, ha az Mmt a peptid C-terminus felé helyezkedik el. A hosszan tartó 2%-os TFA-kezelés az aminosav-oldalláncok védőcsoportjainak elvesztéséhez vezethet.

A szulfhidril peptidek kezelése

A szulfhidril peptideket a légköri oxigén könnyen oxidálja, ezért a hasítás után azonnal fagyasztva kell szárítani és argon alatt szárazon tárolni. Az idő előtti oxidáció minimalizálása érdekében a cisztein-tartalmú peptideket savas (0,1% TFA) gáztalanított pufferekben kell kezelni. Az analízishez a HPLC-puffereket is He-sugárzással kell gáztalanítani. A több Cys-maradékot tartalmazó peptideknél a hasítást követően szükség lehet redukcióra.

Disulfidkötés képződése ciszteinil peptidek oxidációjával

Szulfhidril peptidek véletlenszerű oxidációja

Az egy vagy több diszulfidhíd kialakításának legegyszerűbb módszere a szabad szulfhidril peptid véletlenszerű oxidációja. A kettőnél több Cys-maradékot tartalmazó peptidek esetében a képződő termékek összetétele változhat attól függően, hogy az oxidáció termodinamikai vagy kinetikai kontroll alatt történik-e.

Thermodinamikai kontroll

Ezek közül a legegyszerűbben elvégezhető eljárás a levegőn történő oxidáció, amely termodinamikailag a legstabilabb terméket adja. Az eljárás során a peptid vizes oldatát egyszerűen kitesszük a légkörnek egy illékony pufferben, majd a peptidet liofilizálással izoláljuk. Kis monociklusos peptidek könnyen előállíthatók a Cys(Trt) TFA hasítását közvetlenül követő légoxidációval, a köztes szulfhidril peptid tisztítása nélkül (6. módszer). Ennek az eljárásnak az a hátránya, hogy a reakciók néha nagyon lassúak lehetnek. Azt is kimutatták, hogy az aktív szén hatékonyan katalizálja ezt a folyamatot¹⁷.

6. módszer: Légoxidáció

1. A ciszteinil peptidet oldjuk fel 0.1 M deaerált ammónium-bikarbonátban (0,1-10 mg/ml).
2. Az elegyet hagyjuk a légkör felé nyitottan állni, amíg a reakció be nem fejeződik. (A reakciót vagy HPLC-vel vagy a Ellman-teszttel lehet nyomon követni).
3. Iszoláljuk a terméket liofilizálással.

MEGJEGYZÉS: A lineáris peptid koncentrációja optimalizálást igényelhet a polimerképződés minimalizálása érdekében. A polimeres anyag Sephadex G-15 oszlopon történő sótalanítással eltávolítható.

7. módszer: Glutation-oxidáció

1. A ciszteinilpeptidet oldjuk fel 0.2 M víztelenített foszfát pufferben, pH 7,5 (0,1 - 10 mg/ml), amely 1 mM EDTA-t, redukált (5 mM) és oxidált (0,5 mM) glutationt tartalmaz.
2. Keverjük az elegyet 1-2 napig, miközben a reakciót HPLC-vel követjük nyomon.
3. Iszoláljuk a terméket liofilizálással és sótalanítsuk HPLC-vel vagy GPC-vel.

A cisztein és cisztin vagy redukált és oxidált glutation keverékével történő oxidáció hasznos a több diszulfidhidat tartalmazó peptidek oxidációjához. A felesleges redukált komponens jelenléte a köztes hidakkal rendelkező peptidek lassú átrendeződését eredményezi a termodinamikailag legstabilabb izomerré.

Kinetikus oxidáció

Változatos oxidálószereket használtak a diszulfidhidak gyors kialakítására a kinetikailag legkedvezőbb termék előállítása érdekében. Ezek közé tartozik a kálium-ferricyanid¹⁸, a jód¹⁹, a DMSO^{20, 21}, a DMSO^{20, 21}, N-klórszukcinimid (NCS) ²² és DPDS (2,2'-ditiopiridin)²³.

A jóddal történő oxidáció rendkívül gyors, és úgy lehet elvégezni, hogy jódoldatot csepegtetünk a gyorsan kevert peptidoldatba, amíg az oldat előzetesen sárgára nem színeződik.

A DMSO-oxidáció nagyon enyhe, és 3 és 8 közötti pH-értékeknél működik. Érzékeny maradékokat (Met, Trp, Tyr) érintő mellékreakciókról nem számoltak be.

NCS-t DMF-ben használtak a szulfhidrilek oxidációjára a szilárd fázisban, már 2 ekvivalens is befolyásolta az oxidációt 15 perc alatt²². Ez a reagens a metionin oxidációját is okozhatja.

8. módszer: Szabad szulfhidril peptidek jódos oxidációja

1. A ciszteinil peptidet feloldjuk (0.1 -10 mg/ml) gázmentesített AcOH/vízben vagy MeOH/vízben.
2. Helyezzünk hozzá cseppenként 0,06 M jódot MeOH-ban, gyors keverés mellett, amíg az oldat enyhén sárga színt nem kap. A felesleges jódot oltsuk le 1M aszkorbinsavval.
3. Iszoláljuk a terméket liofilizálással és sótalanítsuk HPLC-vel vagy GPC-vel.

9. módszer: DMSO-oxidáció

1. Oldjuk fel a ciszteinilpeptidet AcOH-ban. Hígítsuk vízzel (0,1 - 10 mg/ml-re.
2. Adjunk hozzá ammónium-karbonátot pH 6-ig, majd DMSO-t (10 térfogatszázalék).
3. Keverjük az elegyet 4 - 24 órán keresztül, miközben a reakciót HPLC-vel követjük.
4. Iszolváljuk a terméket HPLC-vel.

10. módszer: DPDS oxidáció²³

1. Oldjuk fel a ciszteinilpeptidet (0,1 - 10 mg/ml) 0.1 M ammónium-bikarbonátban.
2. Adjunk hozzá 5 mM DPDS oldatot MeOH-ban (3 ekv.).
3. Keverjük az elegyet 30-120 percig, miközben a reakciót HPLC-vel követjük.
4. TFA-val savasítsuk és HPLC-vel izoláljuk a terméket.

11. módszer: NCS on-gyanta oxidáció²²

1. Eltávolítjuk a Cys-STmp vagy Mtt csoportokat a szilárd fázison. Mossuk a gyantát DMF-fel.
2. Mossuk a peptidil-gyantát NCS-vel (2 ekv.) DMF-ben 15 percig rt-en.
3. Mossuk a gyantát DMF-fel és DCM-mel. Hasítsa le a peptidet a gyantáról. A tiol-radírokat nem szabad használni, mivel ezek a reagensek a diszulfidkötés redukcióját okozzák. A legtöbb esetben az EDT helyettesíthető TIS-szel.

Disulfidkötés képződése védett ciszteinil peptidek oxidációjával

Diszulfidkötés kialakulása jódoxidációval

A Cys(Acm)/Cys(Trt) maradékokat tartalmazó peptidek jóddal történő kezelése a szulfhidril védőcsoportok egyidejű eltávolítását és diszulfidkötés kialakulását eredményezi. Az egyetlen Cys-maradékot tartalmazó peptidek szimmetrikus dimerré alakulnak át, míg a több maradékot tartalmazó peptidek az oldószertől és a koncentrációtól függően ciklikus monomer és polimer keverékké alakulnak át. A reakció sebessége erősen oldószerfüggő, ami bizonyos fokú szelektivitást tesz lehetővé a Cys(Trt) és a Cys(Acm) között; dipoláris oldószerekben, mint például aq. MeOH és aq. AcOH, mind a Cys(Trt), mind a Cys(Acm) gyorsan reagál, míg nem poláris oldószerekben, mint például DCM és CHCl₃, a Cys(Acm) oxidációja rendkívül lassú²⁴.

A módszer leggyakoribb alkalmazása a két Cys(Acm)-maradékot tartalmazó, oldallánc-mentesen védett peptidek átalakítása ciklikus diszulfid-híddal rendelkező monomerré; a tritil-védelem alkalmazása nem megfelelő, mivel ez a csoport a TFA hasítás során eltávolításra kerül. A reakciót általában nagy hígításban, aq. MeOH vagy aq. AcOH-ban, az oldószer pontos megválasztása a sorrendtől függ. A reakciók leggyorsabban aq. MeOH; de a Tyr, His és Trp tartalmú peptidek esetében az aq. AcOH-t kell előnyben részesíteni, mivel használata korlátozza ezen érzékeny maradékok jódozását.

A védett peptidfragmentumok oldatban történő jódoxidációjához ajánlott, hogy a diszulfidhídban összekapcsolandó két Cys-maradék közül az egyiket Acm-mel, a másikat Trt-tel védjük. Ez az intézkedés korlátozza a polimerképződést, és lehetővé teszi a nem poláros oldószerkeverékek, például a TFE/CHCl₃ használatát, amelyek kedveznek a védett fragmentum oldódásának. A szabad N-amino funkcióval rendelkező Cys-maradékot tartalmazó peptidek jódos oxidációja rendkívül lassúnak bizonyult, ami valószínűleg az aminocsoport pozitív töltésének eredménye, amely gátolja a szulfonium intermedier kialakulását.

A jód- és tallium(III)-oxidációs reakciók során az Acm ciszteinről a Gln^25a és Ser/Thr^25b maradékok oldalláncaira történő migrációjáról számoltak be

12. módszer: Általános módszer a jódoxidációhoz

1. A Cys-Acm peptidet (15 µmol) AcOH-ban (30 ml) feloldjuk. Takarjuk el N₂ alatt.
2. Adjunk hozzá 160 mM aq. HCl-t (5 mL). Adjunk hozzá 20 mM I₂ -t AcOH-ban (45 mL).
3. 30-120 perc erőteljes keverés után (a kiindulási anyag eltűnése után) oltsuk a jódot 1 M aq. nátrium-tioszulfát vagy aszkorbinsav cseppenkénti hozzáadásával, amíg az elegy színtelen nem lesz, majd csökkentett nyomáson történő bepárlással koncentráljuk az eredeti térfogat kb. egyharmadára. Izoláljuk a terméket HPLC-vel.

Változatosan²⁶:

3.  30 -120 perc erőteljes keverés után adjunk hozzá 480 ml hideg dietil-étert. Hűtsük szárazjégen 10 percig. A peptidet centrifugálással izoláljuk.

A felesleges jódot az oldat CCl₄-val történő extrakciójával, vagy aktív szénnel vagy Zn porral történő kezeléssel is eltávolíthatjuk.

Két diszulfid egyfazékos képzése ([27] alapján)

1. A 2xCys, 2xCys-Acm peptidet AcOH-ban (2 mg/ml) oldjuk fel N₂ takaró alatt.
2. Adjunk hozzá kb. 1 ekv. I₂ -t, mint 0,5 M I₂ -t cseppenként MeOH-ban, amíg tartós barna színt nem kapunk. Adjunk hozzá további 9 ekv. jódot. Adjunk hozzá vizet, a felhasznált AcOH térfogat 20%-át és keverjük az elegyet
3. A felesleges jódot a fent leírtak szerint távolítsuk el

Tálium-trifluoracetát oxidáció

A jódhoz hasonlóan a Tl(CF₃CO₂)₃ a több Cys(Acm)-maradékot tartalmazó peptideket a megfelelő diszulfidhíddal rendelkező cisztin peptidekké alakítja át [28]. Oldatban ezt a reakciót általában TFA-ban végezték, mivel ez kiváló oldószer mind a szabad, mind a védett peptidek számára. A szilárd fázisban történő közvetlen diszulfidkötésképzéshez DMF-et alkalmaztak oldószerként, amely a peptidláncok idő előtti hasadása nélkül jó gyantaduzzadást tesz lehetővé. Fontos megjegyezni, hogy a Met-et és a Trp-t védeni kell a Tl(CF₃CO₂)₃ kezelés során, hogy elkerüljük ezen érzékeny maradékok oxidációját; Met(O) és Trp(Mts), illetve Trp(Boc) kezelését a t-Boc²⁸ és Fmoc^29,30 stratégiákkal együtt alkalmazták.

FIGYELMEZTETÉS: A talliumsók erősen mérgezőek és maró hatásúak; nagy körültekintéssel kell eljárni e reagensek használata során.  Megfelelő szemvédelem, laboratóriumi köpeny és kesztyű viselése kötelező. Kövesse a helyi, állami/tartományi és szövetségi biztonsági előírásokat.  Használja hatékony füstgázszekrényben.

13. módszer: Oldatfázisú oxidáció Tl(III)²⁸

1. Oldjuk fel a peptidet TFA-ban (1-10 mg/ml) anizollal (10 µ.L/mg), és hűtsük le jégfürdőben
2. Adjunk hozzá Tl(CF₃CO₂)₃ (1.2 ekv.) és hagyjuk reagálni 5-18 órán át.
3. A TFA-t vákuumban történő bepárlással távolítsuk el, és a peptidet éterrel csapassuk ki. Centrifugáljuk és dekantáljuk az étert, eltávolítva a felesleges talliumreagenseket.
4. Adjunk hozzá friss étert, rázzuk a csövet a peptid diszpergálásához és centrifugáljuk. Dekantáljuk az étert, és ismételjük meg a mosási folyamatot háromszor.

14. módszer: Szilárd fázisú oxidáció Tl(III) ^{29, 30}

1. Suszpendáljuk a peptidgyantát DMF/anisolban (19:1) és adjunk hozzá Tl(CF₃CO₂)₃ (1.2 ekv. a peptidhez képest)
2. 80 percig hagyjuk állni 0 °C-on, majd DMF-fel mossuk a gyantát
3. TFA-val távolítsuk el a peptidet a gyantáról. A tiol-radírokat nem szabad használni, mivel ezek a reagensek a diszulfidkötés redukcióját okozzák. A legtöbb esetben az EDT helyettesíthető TIS-szel.

Regioszelektív diszulfidkötés-képzés

A több diszulfidot tartalmazó peptidek szelektív hídképzéssel történő szintézise nem olyan feladat, amelyre könnyedén vállalkozhatunk. A többszörös diszulfidkötést tartalmazó peptidek szintézisében a legjobb eredményeket gyakran véletlenszerű oxidációval érjük el, mivel a kívánt biológiailag aktív izomer általában a termodinamikailag legstabilabb. Az egyik peptidnél bevált módszerek nem feltétlenül működnek egy másik peptidnél. Néha két hidat gond nélkül ki lehet alakítani, de a harmadik hidat már nem lehet kialakítani. Továbbá a hidak kialakításának sorrendje gyakran döntő fontosságú. Az első híd szelektív kialakulása mintát adhat a többi híd véletlenszerű oxidációval történő helyes kialakításához. Ez jelentős időbefektetést igényel, a sikerre nincs garancia.

A két diszulfidkötés szelektív kialakításához a Trt és Acm, vagy az STmp és Acm védelem kombinációja használható: az első diszulfidkötés a Trt vagy STmp védelem szelektív eltávolítása után jön létre; a második diszulfidkötés létrehozása ezután egyetlen lépésben történik az Acm védett peptid jóddal vagy tallium-trifluoracetáttal történő kezelésével. Alternatív megoldásként Trt és Acm esetén egy egytégelyes reakciót is el lehet végezni oldatban, ahol az első diszulfidot a diszulfhidril peptid gyors oxidációjával, sztöchiometrikus mennyiségű jóddal képezzük, majd a felesleges jód és víz hozzáadásával az Acm-védett tiolok oxidációját végezzük (12. módszer).

Az STmp és az Mmt kombinációja elősegíti a két híd szelektív kialakulását a szilárd fázisban²². Az STmp-csoportokat merkaptoentanolos kezeléssel távolítjuk el (4. módszer), az első hidat pedig NCS-sel történő oxidációval képezzük (11. metódus). Az Mmt eltávolítása 2%-os TFA-val DCM-ben (5. módszer), majd ismét NCS-sel történő oxidálással a második hidat kapjuk.

2. táblázat Védőcsoport-kombinációk többszörös diszulfidkötések szelektív szintéziséhez.

Először	Második	Harmadik	Megjegyzések
Trt	Acm		1: Híd légoxidációval vagy sztöchiometrikus I2 oxidációval. 2: felesleges I2 oxidációval.
tBu	MeBzl		Hőmérsékletvezérelt oxidáció DMSO/TFA-val
STmp	Mmt		Mindkét híd gyantán történő kialakulása NCS oxidációval
Mmt	Dpm	Dpm			Egy híd gyantás kialakulása. Második híd képződik oldatban levegőben oxidációval
STmp	Acm		1: Gyantán NCS oxidációval. 2: szilárd vagy oldatfázisú I2 oxidációval.
STmp	Mmt	Acm	1 & 2: Mindkét híd gyantán történő kialakulása NCS oxidációval. 3: I2 oxidáció oldatban.
STmp	Mmt	tBu	1 & 2: Mindkét híd gyantán történő kialakulása NCS oxidációval. 3: DMSO/TFA vagy MeSiCl3/Ph2SO oldatban
Trt	Acm	tBu	1: Híd légoxidációval vagy sztöchiometrikus I2 oxidációval. 2: felesleges I2 oxidációval. 3: TFA/DMSO vagy MeSiCl3/Ph2SO.
Trt	tBu	MeBzl	1: Híd légoxidációval vagy sztöchiometrikus I2 oxidációval. 2 & 3: TFA/DMSO-val történő hőmérséklet-szabályozott oxidációval

t-Butil védelem, egylépéses hasítással és ciklizációval együtt MeSiCl₃/Ph_{2<-vel2SO, egy harmadik diszulfidhíd bevezetésére használták, ami a -konotoxin és az inzulin³¹ szelektív szintéziséhez vezetett. Hasonló módon a tBu és MeBzl cisztein védelem kombinációját alkalmazták a -konotoxin SI³² két diszulfidkötésének regioszelektív egytéglás képzése során. Az első diszulfidkötést a tBu-csoportok lehasításával és egyidejű oxidációjával alakítottuk ki TFA/DMSO/anisollal szobahőmérsékleten. Az ezt követő 70 °C-ra történő melegítés a MeBzl csoportok hasadását és a második diszulfidhíd kialakulását eredményezte. További példák e megközelítés alkalmazására többszörösen áthidalt peptidek szintézisében lásd a^33-36 hivatkozásokat. Ezek a módszerek a Met és Trp maradékok oxidációját okozhatják.}

15. módszer: MeSiCl₃/Ph₂SO oxidáció³¹

1. A Cys-tBu peptidet TFA-ban oldjuk fel (1 - 10 mg/ml)
2. Adjunk hozzá Ph₂SO-t (10 ekv.), CH₃SiCl₃  (100-250 ekv.) és anizol (100 ekv.).)
3. A reakciót 10-30 percig 25 °C-on hagyjuk folyni
4. A reakciót NH₄F (300 ekv.) segítségével oltsuk le, és a peptidet nagy mennyiségű hideg dietil-éter hozzáadásával csapassuk ki és izoláljuk. centrifugálással

16. módszer: TFA/DMSO oxidáció³²

1. A peptidet TFA/DMSO/anisolban oldjuk fel (97.9/2/0,1) (2 mg/ml)
2. Keverjük szobahőmérsékleten 40 percig. Adjunk hozzá egy további aliquot TFA/DMSO/anisol (40 mikroL/mg peptid)
3. Hőzzük 70 °C-on 3 órán át. Csapasszuk ki a peptidet dietil-éterrel, és centrifugálással izoláljuk.

Aszimmetrikus diszulfidok

S-Npys védett peptidek gyorsan reagálnak tiolokkal széles pH-tartományban vegyes diszulfidok ^{képzése céljából.37}, így ez a védőcsoport különösen hasznos peptid-fehérje konjugátumok vagy olyan peptidek előállításához, amelyek két különböző láncot diszulfidhíddal kötnek össze^38-41. Mivel azonban az Npys-csoport Fmoc-kémia alkalmazásakor a piperidinnel szemben instabil, a Cys(Npys)-maradékot általában a peptid N végpontján vezetik be Boc-Cys(Npys)-OH használatával.  Alternatív megoldásként azt találták, hogy az Npys csoportot posztszintetikusan bármely Trt védett Cys-maradékhoz hozzá lehet adni úgy, hogy 5 ekvivalens 2,2'-ditio-bisz-(5-nitropiridin)-t adunk a standard TFA/TIS/víz (95:2.5:2,5) hasítóelegy⁴².

A Cys(tBu) közvetlen átalakítását Cys(Pys)-re Cys(Acm) és diszulfidhíd jelenlétében DPDS/tioanizol/TFA/TFMSA⁴³ kezeléssel értük el. Ezzel a módszerrel aktivált relaxin-A-láncot, az inzulinszerű hormon relaxin⁴³ szintézisének kulcsfontosságú intermedierjét állítottuk elő.

17. módszer: tBu-Pys átalakítás⁴³

1. A Cys-tBu peptidet és a DPDS-t (4 ekv.) TFA-ban és tioanizolban (9:1 v/v) (50 mg/ml).
2. A keveréket jégen hűtöttük, majd hasonló térfogatú TFMSA-t adtunk TFA-ban (1:4 v/v), és a reakciót 45 percig folytattuk 0 °C-on.
3. A Cys(Pys)-peptidet hideg dietil-éterrel kicsapattuk és centrifugálással izoláltuk. A pelletet 4-szer mossuk át friss éterrel a felesleges DPDS eltávolítása érdekében.

Disulfid kötések redukciója

Redukció DTT-vel

A DTT (termékkód 233153-M) W.W. Cleland⁴⁴ általi bevezetése óta a cisztinilpeptidek redukciójának standard reagensévé vált. Kevés szaga van, jól oldódik vízben, és pH 8-on vizes közegben kvantitatív módon redukálja a diszulfidokat.

18. módszer: Redukció DTT-vel

1. Oldjuk fel a peptidet 0.1 M ammónium-bikarbonátban (1-3 mg/ml).
2. Adjunk hozzá DTT-t (5-szeres felesleg a tiolcsoportokhoz képest).
3. Blankítsuk az elegyet N₂-val és hagyjuk állni 6 órán át.
4. AcOH-val savasítsuk meg az elegyet és liofilizáljuk.
5. A DTT-t gélszűréssel távolítsuk el.

Redukció TCEP-vel

A TCEP egy vízben oldódó foszfin, amely széles pH-tartományban (1,5 -9,0)⁴⁵ redukálja a diszulfidokat. A tiol-alapú redukálószerekkel ellentétben a TCEP nem érzékeny az oxigénre, így nincs szükség különleges óvintézkedésekre a levegő kizárására. A reakció irreverzibilis és kinetikusan szabályozott, ellentétben a DTT-vel való reakcióval, amely termodinamikusan szabályozott⁴². A TCEP használata ideális olyan peptidek redukciójára, amelyek nem oldódnak a DTT-vel történő redukcióhoz szükséges pH 8-on. Meg kell jegyezni, hogy a peptid hosszan tartó érintkezése a TCEP feleslegével a ciszteinmaradványok kéntelenítését okozhatja.

19. módszer: Redukció TCEP-vel

1. A peptidet oldjuk fel bármilyen alkalmas vizes/szerves oldószer keverékben (1-3 mg/ml, pH ).
2. Adjunk hozzá TCEP-t (5-szörös felesleg a diszulfidhoz képest).
3. 1 órán át óvatosan keverjük az oldatot.
4. Tisztítsuk meg a redukált peptidet HPLC-vel vagy gélszűréssel.

Ellman-teszt

Az 5,5'-Ditióbisz(2-nitrobenzoesav) (DTNB) kvantitatív módon reagál alifás szulfhidrilcsoportokkal, és sárga aniont hoz létre. Ez a reakció felhasználható a levegőben zajló oxidációs reakciók előrehaladásának követésére. A reakcióelegyből megfelelő időközönként mintát veszünk, és megvizsgáljuk a tioltartalmat^{46, 47}.

20. módszer: Ellman-teszt

1. Oldjuk fel a DTNB-t (40 mg) 0.1 M nátrium-foszfát pufferben, pH 8 (10 mL).
2. Vegyünk mintát a reakcióelegyből, és hígítsuk pufferrel, hogy 3 mL oldatot kapjunk, amely 0,1-0,2 µmol peptidet tartalmaz. Adjunk DTNB reagens (0,1 mL) a peptidoldathoz, és hagyjuk az elegyet 15 percig állni. Mérje meg az abszorbanciát 410 nm-en 1 cm-es küvettával.
3. Készítsen referenciaoldatot úgy, hogy DTNB reagens (0,1 mL) hozzáadásával pufferhez (3 mL), és mérje meg az abszorbanciát.
4. Számítsa ki a szulfhidrilcsoportok koncentrációját a következő egyenlet segítségével; [SH] = [A410(minta)-A410(referencia)]/13650.

.

Hivatkozások

Hivatkozások

1. Albericio F. 2000. Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford: University Press.

2. Shabanpoor F. 2013. Peptide Synthesis & Applications Methods in Molecular Biology. 1047 , 81. Human Press.

3. Akcam M, Craik D. 2013. Peptide Synthesis & Applications Methods in Molecular Biology. 1047(89):

4. Kaiser T, Nicholson G, Kohlbau H, Voelter W. 1996. Racemization studies of Fmoc-Cys(Trt)-OH during stepwise Fmoc-Solid phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 37(8):1187-1190. https://doi.org/10.1016/0040-4039(95)02406-9

5. Han Y, Albericio F, Barany G. 1997. Occurrence and Minimization of Cysteine Racemization during Stepwise Solid-Phase Peptide Synthesis1,2. J. Org. Chem.. 62(13):4307-4312. https://doi.org/10.1021/jo9622744

6. Lukszo J, Patterson D, Albericio F, Kates SA. 1996. 3-(1-Piperidinyl)alanine formation during the preparation ofC-terminal cysteine peptides with the Fmoc/t-Bu strategy. Lett Pept Sci. 3(3):157-166. https://doi.org/10.1007/bf00132978

7. Giralt E, Andreu D, Atherton E. 1990. Peptides. Proc. 21st European Peptide Symposium; Leiden Escom: p. 243.

8. FUJIWARA Y, AKAJI K, KISO Y. 1994. Racemization-Free Synthesis of C-Terminal Cysteine-Peptide Using 2-Chlorotrityl Resin.. Chem. Pharm. Bull.. 42(3):724-726. https://doi.org/10.1248/cpb.42.724

9. Pearson D, Blanchette M, Guindon C. 1989. Tetrahedron Letters. 30,21. Great Britain: Pergamon Press plc.

10. Ramos-Tomillero I, Rodríguez H, Albericio F. 2015. Tetrahydropyranyl, a Nonaromatic Acid-Labile Cys Protecting Group for Fmoc Peptide Chemistry. Org. Lett.. 17(7):1680-1683. https://doi.org/10.1021/acs.orglett.5b00444

11. Góngora-Benítez M, Mendive-Tapia L, Ramos-Tomillero I, Breman AC, Tulla-Puche J, Albericio F. 2012. Acid-Labile Cys-Protecting Groups for the Fmoc/tBu Strategy: Filling the Gap. Org. Lett.. 14(21):5472-5475. https://doi.org/10.1021/ol302550p

12. TAMAMURA H, OTAKA A, NAKAMURA J, OKUBO K, KOIDE T, IKEDA K, IBLKA T, FUJII N. Disulfide bond-forming reaction using a dimethyl sulfoxide/aqueous HCl system and its application to regioselective two disulfide bond formation. 45(4):312-319. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1995.tb01043.x

13. Veber D, Milkowski J, Varga S, Denkewalter R, Hirschmann R. 1972. Acetamidomethyl. A Novel Thiol Protecting Group for Cysteine. J. Am. Chem. Soc.. 94(15):5456-5461. https://doi.org/10.1021/ja00770a600

14. NISHIMURA O, KITADA C, FUJINO M. 1978. New method for removing the S-p-methoxybenzyl and S-t-butyl groups of cysteine residues with mercuric trifluoroacetate.. Chem. Pharm. Bull.. 26(5):1576-1585. https://doi.org/10.1248/cpb.26.1576

15. Albericio F. 2000. Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford University Press.

16. Postma TM, Giraud M, Albericio F. 2012. Trimethoxyphenylthio as a Highly Labile Replacement fortert-Butylthio Cysteine Protection in Fmoc Solid Phase Synthesis. Org. Lett.. 14(21):5468-5471. https://doi.org/10.1021/ol3025499

17. WEBER U, HARTTER P. 1970. S-Alkylmercapto-Gruppen zum Schutz der SH-Funktion des Cysteins, I. Synthese und Stabilität einigerS-(Alkylmercapto)cysteine. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 351(2):1384-1388. https://doi.org/10.1515/bchm2.1970.351.2.1384

18. Rüegg UT, Gattner H. 1975. Reduction of S-Sulpho Groups by Tributylphosphine: An Improved IVIethod for the Recombination of Insulin Chains. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 356(2):1527-1534. https://doi.org/10.1515/bchm2.1975.356.2.1527

19. BEEKMAN NJ, SCHAAPER WM, TESSER GI, DALSGAARD K, KAMSTRUP S, LANGEVELD JP, BOSHUIZEN RS, MELOEN RH. Synthetic peptide vaccines: palmitoylation of peptide antigens by a thioester bond increases immunogenicity. 50(5):357-364. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1997.tb01195.x

20. Góngora-Benítez M, Tulla-Puche J, Paradís-Bas M, Werbitzky O, Giraud M, Albericio F. 2011. Optimized Fmoc solid-phase synthesis of the cysteine-rich peptide linaclotide. Biopolymers. 96(1):69-80. https://doi.org/10.1002/bip.21480

21. 1998. Correspondence. Journal of Clinical Epidemiology. 51(4):365. https://doi.org/10.1016/s0895-4356(97)00299-0

22. McCurdy S. 1989. The investigation of Fmoc-cysteine derivatives in solid phase peptide synthesis. . Pept Res. . 2(1):147-152.

23. POHLS M, AMBROSIUS D, GRÖTZINGER J, KRETZSCHMAR T, SAUNDERS D, WOLLMER A, BRANDENBURG D, BITTER-SUERMANN D, HÖCKER H. Cyclic disulfide analogues of the complement component C3a Synthesis and conformational investigations. 41(4):362-375. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1993.tb00452.x

24. Otaka A, Koide T, Shide A, Fujii N. 1991. Application of dimethylsulphoxide(DMSO) / trifluoroacetic acid(TFA) oxidation to the synthesis of cystine-containing peptide. Tetrahedron Letters. 32(9):1223-1226. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)92050-1

25. Tam JP, Wu CR, Liu W, Zhang JW. 1991. Disulfide bond formation in peptides by dimethyl sulfoxide. Scope and applications. J. Am. Chem. Soc.. 113(17):6657-6662. https://doi.org/10.1021/ja00017a044

26. Postma TM, Albericio F. 2013. N-Chlorosuccinimide, an Efficient Reagent for On-Resin Disulfide Formation in Solid-Phase Peptide Synthesis. Org. Lett.. 15(3):616-619. https://doi.org/10.1021/ol303428d

27. Maruyama K, Nagasawa H, Suzuki A. 1999. 2,2?-Bispyridyl disulfide rapidly induces intramolecular disulfide bonds in peptides. Peptides. 20(7):881-884. https://doi.org/10.1016/s0196-9781(99)00076-5

28. Kamber B, Hartmann A, Eisler K, Riniker B, Rink H, Sieber P, Rittel W. 1980. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation ofS-Trityl-cysteine andS-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helv. Chim. Acta. 63(4):899-915. https://doi.org/10.1002/hlca.19800630418

29. LAMTHANH H, ROUMESTAND C, DEPRUN C, MÉNEZ A. Side reaction during the deprotection of (S-acetamidomethyl)cysteine in a peptide with a high serine and threonine content. 41(1):85-95. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1993.tb00118.x

30. Zhang S, Lin F, Hossain MA, Shabanpoor F, Tregear GW, Wade JD. 2008. Simultaneous Post-cysteine(S-Acm) Group Removal Quenching of Iodine and Isolation of Peptide by One Step Ether Precipitation. Int J Pept Res Ther. 14(4):301-305. https://doi.org/10.1007/s10989-008-9148-x

31. NA. NA.

32. FUJII N, OTAKA A, FUNAKOSHI S, BESSHO K, WATANABE T, AKAJI K, YAJIMA H. 1987. Studies on peptides. CLI. Syntheses of cystine-peptides by oxidation of s-protected cysteine-peptides with thallium(III) trifluoroacetate.. Chem. Pharm. Bull.. 35(6):2339-2347. https://doi.org/10.1248/cpb.35.2339

33. Munson MC, Barany G. 1993. Synthesis of .alpha.-conotoxin SI, a bicyclic tridecapeptide amide with two disulfide bridges: illustration of novel protection schemes and oxidation strategies. J. Am. Chem. Soc.. 115(22):10203-10210. https://doi.org/10.1021/ja00075a040

34. ALBERICIO F, HAMMER RP, GARCÍA-ECHEVERRÍA C, MOLINS MA, CHANG JL, MUNSON MC, PONS M, GIRALT E, BARANY G. Cyclization of disulfide-containing peptides in solid-phase synthesis?. 37(5):402-413. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1991.tb00755.x

35. Akaji K, Fujino K, Tatsumi T, Kiso Y. 1993. Total synthesis of human insulin by regioselective disulfide formation using the silyl chloride-sulfoxide method. J. Am. Chem. Soc.. 115(24):11384-11392. https://doi.org/10.1021/ja00077a043

36. Cuthbertson A, Indrevoll B. 2000. A method for the one-pot regioselective formation of the two disulfide bonds of ?-conotoxin SI. Tetrahedron Letters. 41(19):3661-3663. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)00437-8

37. Atherton E, Sheppard RC, Ward P. 1985. Peptide synthesis. Part 7. Solid-phase synthesis of conotoxin G1. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1.2065. https://doi.org/10.1039/p19850002065

38. Yang Y, Sweeney WV, Schneider K, Chait BT, Tam JP. 1994. Two-step selective formation of three disulfide bridges in the synthesis of the C-terminal epidermal growth factor-like domain in human blood coagulation factor IX. Protein Sci.. 3(8):1267-1275. https://doi.org/10.1002/pro.5560030813

39. Akaji K, Fujino K, Tatsumi T, Kiso Y. 1993. Total synthesis of human insulin by regioselective disulfide formation using the silyl chloride-sulfoxide method. J. Am. Chem. Soc.. 115(24):11384-11392. https://doi.org/10.1021/ja00077a043

40. Zamborelli T. 2000. A comparison of folding techniques in the chemical synthesis of the epidermal growth factor?like domain in neu differentiation factor ?/?. Journal of Peptide Research. 55(5):359. https://doi.org/10.1034/j.1399-3011.2000.00672.x

41. Ihlenfeldt H. 1994. Peptides . Proc. 23rd European Peptide Symposium; Leiden ESCOM: p. 369.

42. Nielsen JS, Buczek P, Bulaj G. 2004. Cosolvent-assisted oxidative folding of a bicyclic?-conotoxin ImI. J. Peptide Sci.. 10(5):249-256. https://doi.org/10.1002/psc.531

43. Matsueda R, Aiba K. 1978. A STABLE PYRIDINESULFENYL HALIDE. Chem. Lett.. 7(9):951-952. https://doi.org/10.1246/cl.1978.951

44. DRIJFHOUT J, PERDIJK E, WEIJER W, BLOEMHOFF W. Controlled peptide-protein conjugation by means of 3-nitro-2-pyridinesulfenyl protection-activation. 32(3):161-166. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1988.tb00930.x

45. ALBERICIO F, ANDREU D, GIRALT E, NAVALPOTRO C, PEDROSO E, PONSATI B, RUE-GAYO M. Use of the Npys thiol protection in solid phase peptide synthesis Application to direct peptide-protein conjugation through cysteine residues. 34(2):124-128. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1989.tb01500.x

46. PLOUX O, CHASSAING G, MARQUET A. Cyclization of peptides on a solid support. Application to cyclic analogs of Substance P. 29(2):162-169. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1987.tb02242.x

47. SIMMONDS RG, TUPPER DE, HARRIS JR. Synthesis of disulfide-bridged fragments of ?-conotoxins GVIA and MVIIA. 43(4):363-366. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1994.tb00532.x

48. Ghosh AK, Fan E. 2000. A novel method for sequence independent incorporation of activated/protected cysteine in Fmoc solid phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 41(2):165-168. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(99)02045-6

49. Bathgate RAD, Lin F, Hanson NF, Otvos, L, Guidolin A, Giannakis C, Bastiras S, Layfield SL, Ferraro T, Ma S, et al. 2006. Relaxin-3:  Improved Synthesis Strategy and Demonstration of Its High-Affinity Interaction with the Relaxin Receptor LGR7 BothIn VitroandIn Vivo?. Biochemistry. 45(3):1043-1053. https://doi.org/10.1021/bi052233e

50. Cleland WW. 1964. Dithiothreitol, a New Protective Reagent for SH Groups*. Biochemistry. 3(4):480-482. https://doi.org/10.1021/bi00892a002

51. Burns JA, Butler JC, Moran J, Whitesides GM. 1991. Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl)phosphine. J. Org. Chem.. 56(8):2648-2650. https://doi.org/10.1021/jo00008a014

52. Ellman GL. 1959. Tissue sulfhydryl groups. Archives of Biochemistry and Biophysics. 82(1):70-77. https://doi.org/10.1016/0003-9861(59)90090-6

53. Ellman GL, Courtney K, Andres V, Featherstone RM. 1961. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology. 7(2):88-95. https://doi.org/10.1016/0006-2952(61)90145-9