Ugrás a tartalomra
Merck
KezdőlapPeptid szintézisFmoc gyanta hasítás és védtelenítés

Fmoc gyanta hasítás és védtelenítés

Tartalomjegyzék

Bevezetés

A védett peptid sikeres szintézise után azzal a nehéz feladattal szembesülünk, hogy egyszerre kell leválasztani a peptidet a gyanta hordozóról és eltávolítani az aminosavmaradékok összes oldalláncvédő csoportját, hogy a kívánt peptidet kapjuk. Az Fmoc SPPS-ben ezt a lépést általában a peptidil-gyanta TFA-val történő kezelésével végzik. E folyamat során a gyantán lévő védőcsoportokból és a fogantyúkból nagy reakcióképességű kationos speciesek keletkeznek, amelyek, ha nem kerülnek csapdába, reakcióba léphetnek a nukleofil funkciós csoportokat tartalmazó maradékokkal, és így módosíthatják azokat: Trp, Met, Tyr és Cys. Ennek megakadályozására a TFA-hoz különböző nukleofil reagenseket (ún. scavengert) adnak, hogy elnyomják ezeket az ionokat1, 2

Sok univerzális hasító keveréket javasoltak, amelyek közül a legnépszerűbb a K-reagens (TFA/víz/fenol/tioanizol/EDT [82.5:5:5:5:2.5])1. A védőcsoport- és linker-technológia fejlődése, különösen az Fmoc-Trp(Boc) és Fmoc-Arg(Pmc/Pbf) származékok bevezetése révén azonban az ilyen komplex, toxikus és rossz szagú reagenseket tartalmazó keverékekre már nincs szükség, kivéve kivételes eseteket.

A legtöbb probléma orvosolható a védett aminosav-származék és a gyanta megfelelő megválasztásával (1. táblázat).  Ha ezeket az ajánlásokat követjük, a legtöbb szekvencia esetében elegendő a TFA/TIS/víz (95:2,5:2,5:2,5) használata.  Természetesen vannak olyan szekvenciák, különösen azok, amelyek ciszteint és számos t-butil védett maradékot tartalmaznak, amelyeknél ez az elegy nem ad kielégítő eredményt; ezekben az esetekben EDT hozzáadása az elegyhez vagy K reagens használata ajánlott.  Mindazonáltal, mint általános, nem szagtalan hasító koktél, ez a keverék figyelemre méltóan hatékonynak bizonyult.

Azok számára, akik nem kívánják alkalmazni az 1. táblázatban megadott ajánlásokat, az 1. ábra -ban látható folyamatábra segít a legmegfelelőbb keverék kiválasztásában.

1. táblázat:Ajánlott védőcsoport és gyantastratégia.

Az N-terminális Fmoc-csoport eltávolítása

A peptidil-gyanta savas hasítása előtt az N-terminális Fmoc-csoportot piperidinnel el kell távolítani. Ellenőrizze a szintetizátor használati utasításában; sok szintetizátor automatikusan beprogramozza az N-terminális Fmoc-csoport eltávolítását a szintézis utolsó lépéseként.

A peptidgyanta előkészítése a hasításhoz

A peptidgyantát alaposan át kell mosni, különösen, ha DMF-et használunk a szintézis során, mivel az nem illékony, és a maradék bázikus DMF jelentős gátló hatással lehet a TFA-savbontásra. PEG és poliakrilamid alapú hordozók esetében kívánatos a mosás enyhén savas reagenssel, például ecetsavval, amely nem okozza a peptid felszabadulását, mivel ezek a gyantatípusok hajlamosak a DMF3-t megtartani. A hasítás előtt alapos mosást és szárítást kell végezni (1. módszer).

Megjegyzés: Az ecetsav nem használható a rendkívül savasan labilis Rink savas, TGT vagy 2-klórtritil gyanták mosásához.

1. módszer: A peptidgyanta előkészítése a hasításhoz

  1. Tegye a peptidgyantát egy szinterezett üvegtölcsérbe, és alkalmazzon némi szívást.
  2. Mossuk át DMF-fel, ecetsavval, majd DCM-mel többször. Mosson tovább MeOH-val (polisztirol) vagy éterrel (poliakrilamid), hogy a gyanta zsugorodjon.
  3. Vegye ki a peptidgyantát és szárítsa nagy vákuumban 4 órán át, vagy lehetőleg o/n, KOH felett.

TFA hasítás és védtelenítés

Az optimális hasítási feltételek nagymértékben függnek a jelen lévő egyes aminosavmaradványoktól, azok számától és sorrendjétől, az oldalláncvédő csoportoktól és a gyantához kapcsolt linker típusától.

A különböző peptidgyanták viselkedésének változékonysága miatt ajánlott a peptidgyanták előzetes, kisléptékű hasítását elvégezni 20-50 mg minta felhasználásával az optimális hasítási feltételek, például a peptidgyanta(k) kiválasztása és a reakció hossza meghatározásához.

Ez lehetővé teszi a hasítás mértékének (pl. adott esetben a linkerhez kötött referencia-aminosav mennyiségi elemzésével) és a nyers hasított peptid minőségének (HPLC és aminosavelemzéssel) meghatározását. A peptidek többségénél, amennyiben az 1. táblázatban megadott ajánlásokat követjük, a hasítás TFA/TIS/víz (95:2,5:2,5:2,5) használatával befolyásolható.  Amennyiben problémák merülnek fel, a K-reagens használata vagy EDT hozzáadása a fenti keverékhez általában kielégítő megoldást jelent.

A Rink-amid gyanta esetében a fenil-benziléter kötés, amely a fogantyút a gyantához köti, savérzékeny és elszakadhat, különösen akkor, ha a hasadási reakció során a termék felszabadulása lassú, ami színes melléktermékeket eredményez, amelyek egyszerű mosással nem távolíthatók el könnyen a termékből.  Ez elkerülhető a 3. módszer-ben vázolt 2 lépéses eljárással, vagy még jobban a szilán-leválasztók használatával.  Ezekre a lépésekre nincs szükség a stabilabb módosított Rink-linkereket tartalmazó gyanták esetében, mint például a Rink Amide AM, Rink Amide MBHA gyanta és a NovaSyn® TGR gyanták.

A metionin, cisztein és triptofán rendkívül érzékenyek a hasítási folyamat során keletkező kationok alkilezésére. A triptofán, metionin vagy cisztein reakciója a t-butil kationokkal a termék peptidjének módosítását eredményezi; a linker kationnal való reakció a peptidnek a gyantához3 való visszafordíthatatlan visszakapcsolódását eredményezi. Metioninnal további reakció játszódhat le, amely homoszerint és a peptidlánc fragmentálódását eredményezi. Ha a hasítóelegyhez scavengert adunk, ezek a mellékreakciók nagymértékben elnyomhatók. Kivételt képez a triptofán szulfonálása az Mtr, Pmc és Pbf védett arginin-maradékok4 hasításakor keletkező termékek által. Szerencsére ez a mellékreakció kiküszöbölhető Fmoc-Trp(Boc)5-8 alkalmazásával. Ez a származék elnyomja a C-terminális Trp-maradékok újrakötődését is a gyantakötőnél keletkező kationhoz. A szulfonil alapú védőcsoportok a N-szulfonált Arg9 és O-szulfonált Ser és Thr10 kialakulásához is hozzájárultak.

A leggyakrabban használt szkviteltisztítószer az EDT. Nemcsak a t-butil-kationok számára rendkívül jó scavenger, hanem segíti a cisztein tritil védőcsoportjának eltávolítását, és különösen hatékony a triptofánmaradványok savakkal katalizált oxidációjának megakadályozásában.

A savakkal katalizált Met-oxidáció elnyomása elvégezhető az etil-metil-szulfid (EMS), EDT vagy tioanizol hozzáadásával a scavenger-keverékhez; bár a metionin-szulfoxid képződése minimalizálható, ha a hasítási reakciót nitrogén alatt végezzük, biztosítjuk, hogy csak peroxidmentes étert használjunk a termék kicsapásához, és hogy minden oldószert alaposan gáztalanítsunk a használat előtt. A tioanizolról is ismert, hogy TFA-ban gyorsítja az Arg(Mtr/Pmc/Pbf) eltávolítását; azonban tanácsos óvatosan eljárni e reagens használatakor, mivel vannak arra utaló jelek, hogy a Cys-maradványok11 Acm, tButhio vagy tBu védőcsoportjainak részleges eltávolítását okozhatja.

fmoc-flow

1. ábra: Folyamatábra az Fmoc SPPS hasító koktél kiválasztásához

A fenolról úgy gondolják, hogy némi védelmet nyújt a Tyr- és Trp-maradékoknak1. A trialkilszilánok, mint például a TIS és a TES, bizonyítottan hatékony, nem szagos helyettesítői az EDT12-nak, különösen Arg(Pmc) és Trp(Boc)5, 8 tartalmú peptidek esetében. Ezek a reagensek nagyon hatékonyak a Trt 12, Tmob13, és a Rink-amid linker hasításakor felszabaduló, erősen stabilizált kationok kioltásában is, ezért használatuk erősen ajánlott, ha ezek a részek jelen vannak.

Ha egy peptidben több, kevésbé sav-labilis védőcsoport is jelen van, vagy a peptid hosszú, és ezért számos védőcsoportot tartalmaz, a hasítási időt általában jelentősen meg kell hosszabbítani. Az Mtr-csoport kevésbé sav-labilis, mint a PMC- vagy Pbf-csoportok, és teljes eltávolítása akár 24 órát is igénybe vehet. Ilyen esetekben, amikor a Trp több Mtr védőcsoporttal van jelen, rendkívül hasznos, ha a hasítási feltételeket optimalizálni tudjuk a védőcsoport eltávolításának HPLC-vel történő nyomon követésével. Kompromisszumot kell kötni a részben triptofán-módosított peptid és az Arg(Mtr) nem teljes védővédelme között. Ezért a Trp-t tartalmazó peptidek esetében erősen ajánlott a Trp(Boc)-származékok használata a triptofán oldallánc módosításának elkerülése érdekében.

Hosszú peptidek esetében szükség lehet hosszabb hasítási idő alkalmazására az összes oldallánc-védelem teljes eltávolításához. Ha 6 óra alatt nem sikerül a teljes védelmet eltávolítani, a peptidet éterrel kell kicsapni, és a hasítást friss reagensekkel meg kell ismételni. Az optimális hasítási mód megtalálása érdekében próbahasításokat kell végezni. A hosszú peptidek szintézisénél gyakran figyelmen kívül hagyják a sikertelenség okaként a nem teljes oldallánc-mentesítést.

Problémákat figyeltek meg a N végi Asn(Trt) maradékok lassú védtelenítésével kapcsolatban. Ezek könnyen kiküszöbölhetők a hasítási idő 4 órára való meghosszabbításával vagy Asn(Trt) helyett Asn(Dmcp) használatával.

2. módszer: Általános TFA hasítás

FIGYELEM: A TFA rendkívül maró folyadék; nagy körültekintéssel kell eljárni a reagens használata során. A megfelelő szemvédelem, a laboratóriumi köpeny és a kesztyű használata kötelező. Tartsa be a helyi, állami/tartományi és szövetségi biztonsági előírásokat. Használja hatékony füstelvezetőben.

  1. Tegye a száraz gyantát egy lombikba, és adjon hozzá megfelelő fosztóanyagokat tartalmazó TFA-oldatot (10-25 ml/g gyanta, 1. ábra). MEGJEGYZÉS: számítást kell végezni annak biztosítására, hogy a peptid minőségéhez és a jelen lévő védőcsoportokhoz elegendő scavenger legyen jelen. Zárjuk le a lombikot, és hagyjuk állni rt-nél, időnként megkeverjük. A reakcióidő a szekvenciától függ (lásd alább "A hasítási reakció nyomon követése").
  2. A gyantát csökkentett nyomáson történő szűréssel távolítsa el. Mossuk ki a gyantát kétszer TFA-val. Egyesítsük a szűrleteket, és adjunk hozzá (cseppenként) 8-10-szeres térfogatú hideg étert. Néha a TFA nagy részét el kell párologtatni a nyers peptid jó kicsapódásának eléréséhez. Az éter jéggel lehűthető a kicsapódás további elősegítése érdekében.
  3. Iszolváljuk a peptidet a 17. módszerben leírtak szerint.

3. módszer: Kétlépcsős eljárás a Rink-amidgyanta leválasztására/mentesítésére

    1. A gyantát 10%-os TFA-ban DCM-ben feliszapoljuk, és finom szinterrel üveg tölcsérbe öntjük.
    2. Hagyjuk, hogy az oldószer lassan átszivárogjon a gyantaágyon. Mossuk a gyantát 5%-os TFA-val, hagyjuk, hogy lassan áthaladjon a gyantaágyon. A leválás savakkal katalizált egyensúly, ezért fontos, hogy a levált peptidet folyamatosan távolítsuk el ezzel az áramlási módszerrel. Ha a reakciót lombikban végezzük, nem érjük el a teljes leválasztást. A hozam javítható 1-5% TIS hozzáadásával a hasítóelegyhez.
    3. A felesleges TFA/DCM-t csökkentett nyomáson távolítsuk el, és az aminosav-összetételnek megfelelően 95%-os TFA-val plusz scavengensekkel fejezzük be a leválasztást (lásd 1. ábra).

    A hasítási reakció ellenőrzése

    Az Mtr-védett arginin jelenléte a peptidben elhúzódó reakcióidőt tesz szükségessé, amely a használt scavengerek megválasztásától függően 3 és 6 óra között változik (1. ábra). Több argininmaradék esetén a reakcióidő akár 24 órára is meghosszabbítható. Ilyen esetekben rendkívül hasznos, ha a hasítási körülményeket optimalizálni tudjuk e védőcsoport eltávolításának HPLC-vel történő nyomon követésével.

    Általános protokollok erős savak felhasználásával

    A TFA alternatívájaként a kevésbé sav-labilis oldalláncvédő csoportok, mint például Arg(Mtr/Pmc/Pbf), Asn(Mbh) és Gln(Mbh) gyors leválasztásához a megfelelő scavengersavakkal erősebb savak is használhatók, mellékhatásokról nem kell beszámolni.

    Hármas metil-szililil-bromiddal14

    A több Arg(Mtr)-maradékot tartalmazó peptidek teljes védtelenítéséhez gyakran szükséges hosszú hasítási idő a termék minőségének súlyos romlásához vezethet. Különösen a triptofántartalmú peptidek hosszan tartó TFA-ban történő EDT-expozíciója vezethet a triptofán-maradékok ditioketál-képződés miatti módosításához. A trimetilszililil-bromiddal (TMSBr) történő hasítás kiküszöböli ezeket a problémákat, mivel ez a reagens 15 perc alatt akár 4 Arg(Mtr)-maradványt is tisztán leválaszt. Továbbá, ez a módszer teljesen elnyomja a szulfonálási melléktermékek képződését, még akkor is, ha nem védett triptofánt használunk15.

    4. módszer: Hasítás TMSBr-rel

    1. Adjunk hozzá TMSBr-t (1.32 ml) az EDT (0,50 ml), az m-krezol (0,1 ml) és a tioanizol (1,17 ml) 0°C-ra lehűtött TFA (7,5 ml) oldatához. Adjuk hozzá a peptidgyantát (200 mg), és hagyjuk az elegyet 15 percig állni N2 takaró alatt 0°C-on.
    2. A gyantát csökkentett nyomáson történő szűréssel távolítsuk el. Mossuk ki a gyantát kétszer tiszta TFA-val. Egyesítsük a szűrleteket, és adjunk hozzá (cseppenként) 8-10-szeres térfogatú hideg étert. Néha a TFA nagy részét el kell párologtatni a nyers peptid jó kicsapódásának eléréséhez. Az éter jéggel lehűthető, hogy tovább segítse a kicsapódást.
    3. A peptidet a 17. módszerben leírtak szerint izoláljuk.

    MEGJEGYZÉS: Esetenként a peptid további kezelése ammónium-fluoriddal szükséges az esetlegesen bekövetkezett szilezés visszafordításához.

    Hasítás nagyon savérzékeny gyantákból

    A Rink savas gyanta16, 2-klórtritil17, HMPB, HMPB, HMPB és a Rink savas gyanta16.sup>18, NovaSyn TGT19, és Sieber-gyanták20 nagyon savérzékeny linkereket tartalmaznak, és alkalmasak védett peptidek szintézisére.

    HMPB gyanták &; Sieber amidgyanták

    A HMPB linkerből21 és a Sieber amidgyantából20 védett amidok állíthatók elő. A gondos kísérletezés azonban elengedhetetlen, ha el akarjuk kerülni az oldalláncvédő csoportok idő előtti elvesztését. A peptidilgyanta 1%-os TFA diklórmetánban oldott oldatával történő ismételt kezelése minimális reakcióidővel együtt a legjobb eredményt adja.

    A hasítást lehetőleg lezárható szinterezett üvegtölcsérben kell végezni, hogy megakadályozzuk a nagy illékonyságú DCM elpárolgását, és a szűrést vákuum helyett nitrogénnyomás alkalmazásával kell elvégezni.

    Ha a peptid Met-et vagy Trp-t tartalmaz, a hasítóelegyhez 1% EDT-t kell adni a peptid újbóli megkötésének megakadályozása érdekében. Ha a peptid C-terminális Trp-maradékot tartalmaz, erősen ajánlott a Trp(Boc) használata21.

    Ezzel a tételes eljárással a saverősség lépésről lépésre nő, amit a jelen lévő TFA-puffercsoportok mennyisége határoz meg. A maximális peptidkoncentráció az első vagy a későbbi mosások egyikében lehet, az amidkötések és más jelenlévő funkciós csoportok pufferkapacitásától függően. A t-butil típusú oldalláncvédő csoportok, valamint a Trt (Asn-en és Gln-en) teljesen érintetlenek maradnak a folyamat során21.

    5. módszer: Hasítás híg TFA-val

    1. A száraz gyantát (1 g) egy lezárható szinterezett üvegtölcsérben DCM-mel előáztatjuk, és a felesleges DCM-et eltávolítjuk.
    2. Adjunk 1%-os TFA-t száraz DCM-ben (10 ml), zárjuk le a tölcsért, és rázzuk 2 percig. Szűrjük az oldatot nitrogénnyomás alkalmazásával egy lombikba, amely 10% piridin metanolban (2 ml) tartalmaz.
    3. Ismételjük meg a 2. lépést legfeljebb 10-szer, mossuk ki a maradék védett peptidet a gyantából 3 x 30 ml DCM-mel, 3 x 30 ml MeOH-val, 2 x 30 ml DCM-mel, 3 x 30 ml MeOH-val, és ellenőrizzük a szűrleteket TLC-vel vagy HPLC-vel.
    4. A terméket tartalmazó szűrleteket egyesítsük, és csökkentett nyomáson pároljuk be a térfogat 5%-áig. Adjunk vizet (40 ml) a maradékhoz és hűtsük le az elegyet jéggel, hogy elősegítsük a termék kicsapódását.
    5. Iszoláljuk a terméket szinterezett üvegtölcséren keresztül történő szűréssel. Mossuk a terméket háromszor friss vízzel. Szárítsuk a mintát exszikkátorban vákuumban KOH felett, majd P2O5 felett.

    2-klórtritil, NovaSyn® TGT, és NovaPEG Trt gyanták

    2-klórtritil17, NovaSyn® TGT19 és NovaPEG Trt gyanták a fent leírtak szerint 1%-os TFA-val, vagy enyhébb körülmények között AcOH-val vagy TFE 22 -val hasíthatók védett peptidek előállítása érdekében. A védett peptidek előállítása során a hisztidin bevezetéséhez különösen ajánlott az Fmoc-His(Clt)-OH használata. Ez segít elkerülni a hisztidin részleges oldallánc-mentesítését, ami His(Trt) használata esetén előfordulhat.

    6. módszer: Hasítás TFE/DCM-mel

    1.   Kezeljük a peptidil-gyantát rt-en TFE/DCM-mel (2:8) 3 x1 órán keresztül.

    2.   A megfelelő idő elteltével szűréssel távolítsuk el a gyantát, mossuk át 3-szor hasító keverékkel.

    3.   Pároljuk az oldatot szárazra, és a védett peptidet éterrel csapassuk ki.

    A levált, teljesen védett peptid nagyon hidrofób lesz, és lehet, hogy DMF, DMSO segítségével tovább kell extrahálni a gyantából. A hasítás teljességét a szűrletek TLC-jával ellenőrizhetjük. Tisztítsuk alacsony nyomású kromatográfiával szilikagélen, HPLC-vel fenilszilikán vagy átkristályosítással.

    HMBA és oxim linkerrel kötött peptidek

    A peptid-karboxamidok szintézisénél a HMBA linkert nagyrészt felváltották a Rink-amid típusúak. Mindazonáltal ez a linker még mindig az egyik legrugalmasabb a peptid-gyanta linkerek közül. A peptidek számos különböző nukleofillal szabadíthatók fel a linkerből, így a C-terminálison különböző funkciós csoportokkal rendelkező peptidek keletkeznek3, 22 -25 (2. táblázat). Ezek a protokollok a Boc SPPS-ben használt oximlinkerrel is kompatibilisek.

2. táblázat:A HMBA-linker hasadásából származó termékek.

Módszer 7: Metanolos ammóniás hasítás peptidamidok3, 23

  1. Tegyük a száraz gyantát egy lombikba, és adjunk hozzá 95%-os vizes TFA-t (20 ml/g). Zárjuk le a lombikot, és hagyjuk állni rt-n 1 órán át, időnként kevergetve.
  2. A gyantát csökkentett nyomáson történő szűréssel izoláljuk, és mossuk TFA-val. Dobjuk el a szűrletet. Mossuk a gyantát DCM-mel, 10% DIPEA-t DCM-ben, DCM-mel.  Szárítsuk a gyantát vákuumban P2O5 o/n felett.
  3. Tegyük a szárított gyantát egy tiszta, száraz nyomástartó edénybe és a gyanta megduzzadásához elegendő DMF-be, majd 0°C-on ammóniával telített száraz metanol oldatába (20 ml/g).
  4. Zárjuk le a lombikot és hagyjuk rt-re melegedni. Hagyjuk állni 18 órán át, majd ismét hűtsük le a lombikot 0°C-ra. Óvatosan nyissa fel a lehűtött edényt, és szűrje a gyantát egy szinterezett üvegtölcséren keresztül.
  5. Mossa a gyantát először metanollal, majd TFA-val egy külön lombikba, hogy eltávolítsa a metanolban nem oldódó peptidet.
  6. A szűrleteket külön-külön párolja szárazra egy rotációs elpárologtatón. A peptidet éterrel kicsapjuk és szűréssel izoláljuk.

MEGJEGYZÉS: Ha a peptidgyantát nem szárítjuk meg alaposan ezt a hasítási eljárást megelőzően, melléktermékként peptidsav keletkezhet.

8. módszer: Hidrazinnal történő hasítás a C-terminális hidrazid24

Ha szükséges, az oldalláncvédő csoportokat először a 7. módszer,  1.  2. lépései szerint kell eltávolítani.

  1. Suszpendáljuk a peptidgyantát DMF-ben, és adjunk hozzá 5%-os hidrazin-hidrát DMF-ben oldott oldatát (20 ml/g). Hagyjuk állni 1 órán át rt-nél.
  2. Szűrjük a gyantát egy szinterezett üvegtölcséren keresztül, és mossuk a gyantát először DMF-fel, majd TFA-val egy külön lombikba, hogy eltávolítsuk a DMF-ben nem oldódó peptidet.
  3. A szűrleteket külön-külön pároljuk el szárazra rotációs elpárologtatón. A peptidet éterrel kicsapjuk és szűréssel izoláljuk.

9. módszer: Lúggal történő hasítás a szabad sav3

Az oldalláncvédő csoportokat először a 7. módszer 1. & 2. lépésekkel kell eltávolítani.

  1. A gyantát dioxánban előáztassuk.
  2. 0,1 M NaOH/ dioxán (1:3, 20 ml/g) 0 °C-ra hűtjük jég/vízfürdőben. Adjuk hozzá a peptidgyantát, és hagyjuk állni 15 percig rt-nél.
  3. Szűrjük a gyantát egy szinterezett üvegtölcsér segítségével egy 0,1 M HCl-t (5 ml/g) tartalmazó lombikba. Ezt a lombikot jégfürdőben kell lehűteni, hogy megakadályozzuk a felmelegedést, ahogy a bázisoldat semlegesül.
  4. Mossuk le a gyantát vízzel, és állítsuk be a szűrlet pH-ját 7,0-ra. Liofilizálja a szűrletet, és gélszűréssel távolítsa el a nátrium-kloridot.

10. módszer: Metil-észter24

Az oldalláncvédő csoportokat először a 7. módszer 1. és 2. lépésével kell eltávolítani.

  1. Tegyük a gyantát egy tiszta lombikba, és adjunk hozzá annyi DMF-et, hogy a gyanta megduzzadjon. Hasítsuk o/n DIPEA/MeOH/DMF-fel (1:5:5, 50 ml/g).
  2. Mossuk a gyantát először MeOH/DMF-fel, majd TFA-val egy külön lombikba a metanolban nem oldódó peptid eltávolítása érdekében.
  3. A szűrleteket külön-külön pároljuk el szárazra rotációs elpárologtatón. A peptidet éterrel kicsapjuk és szűréssel izoláljuk.

Ha a hozam alacsony, ismételjük meg a reakciót friss reagensekkel 50°C-on.

11. módszer: Borohidriddel történő hasítás a peptidalkohol25

Ez a módszer csak TG és PEGA típusú gyantákra alkalmazható.

Az oldalláncvédő csoportokat először a 7. módszer 1. & 2. lépéseivel kell eltávolítani.

  1. A peptidil-gyantát (1,0 g) 50%-os vizes EtOH-val kezeljük, és hagyjuk lecsöpögni. Adjunk hozzá NaBH4 (126 mg) 3 ml 50%-os aq. EtOH-ban, és óvatosan keverjük 4 órán át.
  2. A gyantát szűréssel távolítsuk el, és mossuk 50%-os aq. EtOH-val (40 ml), hogy a peptid pH~9-es oldatát kapjuk.

A peptid HMBA-származékkal leválasztása előtt fontos, hogy az oldalláncvédő csoportokat eltávolítsuk, különösen, ha a peptid Asp-ot vagy Glu-t tartalmaz. Ezt a peptidgyanta 95%-os aq. TFA-val történő kezelésével érhetjük el. Ha a peptid Arg(Mtr)-t tartalmaz, az Arg-maradékot a peptidnek a gyantáról való leválasztása után, egy további lépésben, K reagenssel történő kezeléssel a legjobb leválasztani.

A szulfamylbutyryl gyanták által kötött peptidek, tioészterek előállításához

Egy peptidfragmentum kiszorítását alkilezett szulfamilbutiril-gyantából származó tiollal először Pessi és munkatársai26 majd később mások27 - 29  írták le (2. ábra).  A láncolat összeállítását követően a gyantát a szulfonamid nitrogénjének alkilezésével, szokásos jodoacetonitrillel vagy TMS-CHN2-val történő kezeléssel aktiválják.  A jodoacetonitrillel történő aktiválás egy reaktívabb köztes terméket eredményez, míg a TMS-CHN2 esetében a tényleges aktiválási folyamat hatékonyabb. Az aktiválási módszereket a hivatkozásban 30 tekintettük át. Az így kapott N-alkil-N-acilszulfonamidot ezután vagy benzilmerkaptánnal26 vagy etil-merkaptopropionáttal/tiofenollal27 történő kezeléssel hasítjuk.  A TMS-CHN2 -vel történő aktiválás és az etil-merkaptopropionát/tiofenollal történő kiszorítás kombinációja azonban optimálisnak tűnik
(12. módszer).  Kimutatták, hogy a 2M LiBr THF-ben, mint hasító oldószer használata jelentősen jobb peptid-tioészter31hozamot eredményez.

A kapott védett peptid-tioésztert ezután TFA-val és a megfelelő scavengersekkel kezeljük, hogy a védtelenített peptidet kapjuk, amely készen áll a ligáláshoz.

Tioészterek szintézise

2. ábra:Tioészterek szintézise szulfamil-butiril-gyanták felhasználásával

Method12: Tioészter-ligálás szulfamilgyantákkal

Acylszulfamilgyanták aktiválása

  1. A gyantát előáztatjuk (0.1 mmol) száraz THF-ben egy 20 mm-es polietilén szűrővel ellátott 10 ml-es polipropilén fecskendőben.
  2. Adjunk hozzá 5 ml 1 M TMS-CHN2 -t száraz hexánban/THF-ben (1:1).  Zárjuk le a fecskendőt.
  3. 2 órán át óvatosan keverjük.  Mossuk ki a gyantát THF-fel és azonnal használjuk fel, vagy mossuk ki THF-fel, majd DCM-mel és szárítsuk vákuumban.

Tioészterbontás

  1. A metilált gyantát DMF-ben 1 órán át előáztassuk a felhasználás előtt.
  2. Adjunk hozzá etil-3-merkaptopropionátot (50 ekv.) és nátrium-tiofenoxidot (0,5 ekv.), zárjuk le a fecskendőt és keverjük óvatosan az elegyet 24 órán keresztül.
  3. A gyantát szűréssel távolítsuk el és mossuk ki háromszor DMF-fel.
  4. Egyeztessük a szűrleteket, és pároljuk szárazra rotációs elpárologtatón.  A terméket éterrel trituráljuk.
  5. A maradékot kezeljük TFA/víz/TIS/fenol (88:5:2:5) oldattal 2 órán keresztül rt-nél.
  6. Adjuk a hasítóoldatot cseppenként 10 térfogatnyi éterhez, és szűréssel vagy centrifugálással izoláljuk a terméket a szokásos módszerekkel.  Tisztítsuk meg a terméket RP-HPLC-vel.

A nem védett peptidfragmentumok ligálása

  1. Oldjuk fel a peptid-tioésztert (1 ekv.) és az N-terminális-Cys peptidet (1 ekv.) egy csavaros kupakos csőben, amely gázmentesített 0,1 M nátrium-foszfát puffert tartalmaz, pH 7,8. Ha szükséges, az oldat tartalmazhat guanidin-hidrokloridot is (legfeljebb 6 M) a peptidkomponensek oldódásának elősegítésére.  A peptidek végső koncentrációja 2-5 mM legyen.
  2. Adjunk hozzá tiofenolt (a teljes oldat térfogatszázalékát), öblítsük át nitrogénnel, zárjuk vissza a csövet, és keverjük az elegyet erőteljesen. A reakció előrehaladását HPLC-vel lehet nyomon követni. A reakció jellemzően 5-16 óra alatt befejeződik.
  3. A reakciót TFA-val (0,1 térfogatszázalékos oldattal) savasítsuk meg, liofilizáljuk és tisztítsuk a szokásos eljárásokkal.

A hidrazinbenzoilgyanták által kötött peptidek

Az arilhidrazinek oxidációjával előállított aril-diazolok enyhe körülmények között könnyen bomlanak aréneket és nitrogént32 adva. Ezt a folyamatot Millington, et al használta ki.33 alapjául egy újszerű biztonságot adó linker, N-Fmoc-4-hidrazinobenzoesav (3. ábra), amelyet a NovaGel™ gyantához kötve szállítanak.

13. módszer: Hidrazinbenzoil-gyanták oxidatív hasítása

Az amidok előállításához Cu(II)-oxidációval.33

  1. Suszpendáljuk a gyantát tiszta aminban
  2. Adjunk hozzá Cu(OAc)2 (0.5 ekv.), és 4 órán keresztül erőteljesen buborékos levegővel átfújjuk a gyantát.
  3. A gyantát szűréssel eltávolítjuk és DCM-mel átmossuk.
  4. A kombinált szerves szűrleteket szárazra pároljuk. Oldjuk fel újra DCM-ben és mossuk 1 M KHSO4, vízzel és sat. NaCl.
  5. A szerves réteget Na2SO4 fölött szárítsuk meg és pároljuk be szárazra.

Az NBS34

  1. A gyantát száraz DCM-ben szuszpendáljuk
  2. Adjunk hozzá NBS-t (2 ekv.) és száraz piridint (2 ekv.). Óvatosan keverjük 5 percig.
  3. Szűréssel távolítsuk el a gyantát, és mossuk ki száraz DCM-mel és száraz THF-fel.
  4. Rezuszpendáljuk a gyantát száraz DCM-ben, és adjunk hozzá alkoholt vagy amint (5 ekv.) és óvatosan keverjük 4 órán át.
  5. A gyantát szűréssel távolítsuk el és mossuk át DCM-mel.
  6. A kombinált szűrleteket pároljuk szárazra.
alkalmazások-fmoc-4-hidrazinobenzoil-gyanták

3. ábra:Az Fmoc-4-hidrazinobenzoil-gyanták alkalmazásai.

Az Fmoc-csoport eltávolítása után a gyantához kötött hidrazinocsoport könnyen acilezhető a szokásos kapcsolási módszerekkel. A hordozó stabil a piperidinnel és a TFA-val szemben, ami megkönnyíti mind a védett, mind a nem védett peptidfragmentumok szintézisét.

A hasadás enyhe oxidatív körülmények között, levegővel és megfelelő nukleofillal történő kezeléssel, réz(II)-acetát és piridin (vagy DBU) jelenlétében végezhető, így számos karboximódosítást, például savakat, észtereket és amidokat tartalmazó termékeket kapunk.  Azokban az esetekben, amikor a nukleofil komponens rosszul szolválja a gyantát, a reakcióelegybe társoldószert, például THF-et vagy DMF-et kell bevinni.

Alternatívaként a reakció két lépésben is elvégezhető, először a diazolt NBS-szel történő oxidációval előállítva, majd a felesleges oxidálószer eltávolítása után nukleofillel történő hasítással. Ennek a módszernek az az előnye, hogy elkerülhető a termék rézszennyezése. Az elsődleges és másodlagos alkoholok észtereinek szintézisénél Peters & Waldmann34 az NBS aktiválással a legnagyobb hozamot találta. Camarero és munkatársai szintén ezt a módszert alkalmazták peptid p-nitroanilidek35 és peptid tioészterek 36 előállítására p-nitroanilin és aminosav tioészterek nukleofilként történő alkalmazásával.

Ezt a gyantát ciklikus peptidek előállítására is használták  egy ciklikus hasítási stratégián keresztül, amely a N-végső aminocsoport intramolekuláris támadását jelenti a diazol37on.

Az Fmoc-hidrazinobenzoilgyanták alkalmazását nemrégiben áttekintették.38

Dbz-gyantához kötött peptidek

A Dbz gyanták kényelmes megközelítést biztosítanak a peptid-tioészterek és tioészter-szurrogátok Fmoc SPPS39, 40  (lásd 4. ábra).

A hasítás előtt a Dbz-részt aktivált Nbz-vé kell alakítani a 14. módszer szerint. A reakció általában mennyiségi. A nagy terhelésű gyantáknál, mint például a Dawson Dbz AM gyantáknál a Dbz-részek némi keresztkötése előfordulhat. Tapasztalataink szerint sokkal tisztább eredményeket kapunk alacsony töltésű gyantákkal, mint például a Dawson Dbz NovaSyn® TGR gyantával. Az Nbz gyanta TFA-val történő kezelése felszabadítja a teljesen védtelenített peptid-Nbz-t, amely közvetlenül felhasználható az NCL reakcióban. Az Nbz peptidet regioizomerek keverékeként kapjuk.

szintézis-peptid-tioészterek

4. ábra:Peptid-tioészterek szintézise Dbz-gyanták felhasználásával.

Módszer 14: Tioészter-ligálás Dawson Dbz AM gyantával

Szintézis & Aktiválás

  1. A peptidláncot HBTU/HOBt/DIPEA aktiválással hosszabbítsuk meg, kivéve a Gly-t, amelyet Fmoc-Gly-OPfp/HOBt segítségével kell bevezetni. Az N-terminális maradékot Boc-aminosavval kell bevezetni. Mossuk a gyantát DMF-fel és DCM-mel.
  2. Adjunk hozzá p-nitrofenil-kloroformiátot (0,5 mmol) DCM-ben, és hagyjuk gyengén keverni N2 alatt 1 órán át. Mossuk a gyantát DCM-mel, majd adjunk hozzá 0,5 M DIPEA-t DMF-ben (10 ml), és hagyjuk 30 percig. Mossuk a gyantát DMF-fel és DCM-mel.
  3. A peptidet TFA/víz/TIS 95:2,5:2,5:2,5-tel 3 órán át.

A nem védett peptidfragmentumok ligálása

  1. A tisztított peptid-Nbz-t (1 ekv.) és az N-terminális-Cys peptidet (1,5 ekv.) egy csavaros kupakkal lezárt csőben, amely gázmentesített ligációs puffert (0,2 M foszfátpuffer, 6 M guanidin-hidroklorid, 0,2 M 4-merkaptofenil-ecetsav, 0,02 M TCEP, pH 7,0) tartalmaz. A peptidek végső koncentrációjának körülbelül 2 mM-nak kell lennie.
  2. A reakció előrehaladását HPLC-vel ellenőrizze.
  3. A reakciót TFA-val savasítsa (0,1 térfogatszázalékos oldattal), liofilizálja és tisztítsa a szokásos eljárásokkal.

Peptidaldehidek

Elkészítésükhöz három alapvető megközelítés létezik: Először is, egy megfelelő peptidalkohol41 oxidációja; másodszor, egy peptidkarbonsav-származék, például Weinreb-észter42, 43 redukciója.(lásd Módszer 15); végül, lépésenkénti vagy töredékszintézis egy maszkolt, előre kialakított aldehid44 felhasználásával (lásd Módszer 16).

Weinreb-gyantához kötött peptidek

A N-metoxi-N- metoxi-N- redukciójametilamidok (Weinreb-amidok) LiAlH4 vagy DIBAL segítségével történő redukciója jól bevált stratégia peptid- és a-amino-aldehidek42 előállítására. Fehrentz és munkatársai43 ezt a módszert adaptálták az SPOS-ban való felhasználásra, azzal az egyszerű eszközzel, hogy a Weinreb-amid N-metilcsoportját egy olyan linkerrel helyettesítik, amely lehetővé teszi a metoxiamin szilárd hordozóhoz való kötését.

A gyantához kötött másodlagos amin akadályozott jellege miatt HOAt/DIPCDI vagy HATU/DIPEA-t kell használni az első maradék hozzáadásához (4. módszer). Az így kapott hordozó stabil az Fmoc és Boc SPPS feltételeivel szemben. LiAlH4-val történő redukció után Fehrentz, et al. arról számolt be, hogy 30-40%-os hozamú peptidaldehideket kapunk.

Módszer 15: Weinreb-amidok reduktív hasítása

A bizonyos aminosav-oldallánc-funkcionalitásokkal való oldalreakciók elkerülése érdekében általában célszerű minden védőcsoportot a helyén hagyni; ez alól kivételt képez, ha a peptid Asp-ot és Glu-t tartalmaz, mivel még e maradékok t-Bu észtereit is redukálja a LiAlH4. Peptidek esetén a N-terminális aminocsoportot Boc-csoporttal kell blokkolni; az Fmoc-csoport nem stabil ilyen körülmények között.

  1. A gyantát (0,1 mmol) használat előtt 1 órán keresztül száraz THF-ben előkeverjük mágneses keverővel ellátott kerekfenekű lombikban.
  2. Öblítsük át a lombikot argonnal, majd zárjuk le és tegyük jégfürdőbe.
  3. Adjunk hozzá 1 M LiAlH4-t THF-ben (0,5 ml, 0,5 mmola) egy fecskendő segítségével. Keverjük óvatosan 40 percig.
  4. Hígítsuk az elegyet THF-fel és adjunk hozzá telített KHSO4 (0,5 ml) és K, Na-tartarátot (0,3 ml). Óvatosan keverjük az elegyet 30 percig és hagyjuk, hogy felmelegedjen rt-re.
  5. A gyantát szűréssel távolítsuk el és mossuk ki DCM-mel.
  6. Az egyesített szerves szűrleteket szárítsuk vízmentes MgSO4-val és pároljuk szárazra.

aHosszú peptidek esetén a LiAlH4 mennyiségét esetleg növelni kell; fordítva, kis szerves molekulák esetén ez a mennyiség jelentősen csökkenthető.

Módszer 16: A H-Thr-Gly-NovaSyn® TG gyantából történő hasítás

A gyantából történő hasítás és az oldallánc-mentesítés két lépésben történik.

  1. Az oldalláncvédő csoportokat vízmentes TFA-val távolítsuk el.
  2. A peptidaldehidet AcOH/víz/DCM/MeOH (10:5:63:21) (3 x 30 perc) segítségével szabadítsuk ki a gyantából.

A Novabiochem® termékcsalád jelenleg Arg, Asp, Leu, Phe és Val aldehidekkel előretöltött H-Thr-Gly-NovaSyn® TG gyantát kínál.

A hasítás utáni feldolgozás

NEM szabad kidobni a gyantatartót vagy az étert, amíg a peptidanalízis be nem fejeződött. Mindkettő tárolható nitrogén vagy argon alatt 4°C-on az oxidáció megakadályozása érdekében.

Éteres kicsapás

A legtöbb hasítási protokoll a nyers hasított peptid hideg etil-éterrel történő kicsapását foglalja magában. Az alábbiakban a hasítás utáni feldolgozás általános eljárásait ismertetjük.

Módszer 17: Hasítás utáni feldolgozás

A peptidek izolálása és feldolgozása történhet kicsapással (1) vagy centrifugálással (2). Vízben oldódó peptidek esetén a 3-6. lépésben leírt módszer alkalmazható.

  1. Kicsapatás: A kicsapott peptidet szűrjük át keményített szűrőpapíron Hirsch-tölcsérben, enyhe vákuumban. A csapadékot mossuk tovább hideg éterrel, oldjuk fel a peptidet megfelelő vizes pufferben és liofilizáljuk.
  2. Centrifugálás: Adjunk a maradékhoz kis mennyiségű t-butil-metil-étert, és alaposan csavarjuk, amíg szabad szuszpenziót nem kapunk. Vigye át a szuszpenziót egy tiszta centrifugacsőbe, zárja le, és centrifugálja. Elengedhetetlen, hogy ehhez az eljáráshoz szikramentes centrifugát használjunk. Óvatosan dekantáljuk ki az étert a csőből. Szükség szerint ismételje meg az éteres mosást. Oldja fel a visszamaradt szilárd anyagot megfelelő vizes pufferben, és liofilizálja.
  3. Vízben oldódó peptidek: A kicsapást követően adjunk vizet a maradékhoz, és tegyük át az elegyet egy elválasztó tölcsérbe. Az oldódás elősegítéséhez szükség lehet egy kevés AcOH-ra.
  4. Rázza fel jól a dugós tölcsért. Engedje el a dugót, és hagyja, hogy a két réteg állva elváljon egymástól. Izolálja az alsó (vizes) réteget.
  5. Adjon még vizet a tölcsérbe, és ismételje meg a 4. lépést háromszor. Vegyük ki a felső (éteres) réteget, és tároljuk egy tiszta lombikban. Az egyesített vizes kivonatokat tegyük vissza az elválasztó tölcsérbe.
  6. Adjunk hozzá kis mennyiségű friss dietil-étert, és ismételjük meg a 4. lépést két vagy három alkalommal, minden alkalommal eltávolítva az éteres réteget és visszatéve a vizes réteget az elválasztó tölcsérbe. A vizes réteget gyűjtsük össze egy tiszta lombikban, és liofilizáljuk.

A fent leírt módszerekben a peptid hozama gyakran növelhető, ha a TFA-t először egy (CO2/aceton hidegujjal, olajpumpával és savcsapdával felszerelt) rotációs elpárologtatóval távolítjuk el az éteres kicsapási lépés előtt. A legtöbb esetben az éter hozzáadása után a peptid a reakciós lombik oldalához tapad, lehetővé téve, hogy a fosztók gyorsan és könnyen eltávolíthatók legyenek ismételt éteres mosással. Megjegyzés: a TFMSA-t és HBF4-t tartalmazó hasítóelegyeket nem szabad szárazra párolni.

Mivel az alacsony-magas HF hasítási módszerrel előállított peptidek tartalmazhatnak vízben oldódó szulfoniumszármazékokat, célszerű ezeket közvetlenül a liofilizálás előtt eltávolítani, mivel semleges vagy enyhén bázikus körülmények között a metionin- és ciszteinmaradványok alkilálódását okozhatják.

Anyagok
Loading

Hivatkozások

1.
KING DS, FIELDS CG, FIELDS GB. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. 36(3):255-266. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1990.tb00976.x
2.
Albericio F, Kneib-Cordonier N, Biancalana S, Gera L, Masada RI, Hudson D, Barany G. 1990. Preparation and application of the 5-(4-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)aminomethyl-3,5-dimethoxyphenoxy)-valeric acid (PAL) handle for the solid-phase synthesis of C-terminal peptide amides under mild conditions. J. Org. Chem.. 55(12):3730-3743. https://doi.org/10.1021/jo00299a011
3.
Atherton E, Sheppard CR. 1989. Solid phase peptide synthesis: a practical approach. IRL Press, Oxford:
4.
Sieber P, Riniker B. 1987. Protection of histidine in peptide synthesis: A Reassessment of the trityl group. Tetrahedron Letters. 28(48):6031-6034. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)96856-4
5.
Rivier EJ, Marshall RG. Peptides, Chemistry, Structure & Biology, Proc. 11th American Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp 950:
6.
Smith AJ, Rivier EJ. 1992. Peptides, Chemistry, Structure & Biology, Proc. 12th American Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp. 537:
7.
White P. 1991. Novabiochem Satellite Meeting. Solid Phase Synthesis, 2nd International Meeting; Canterbury
8.
CHOI H, ALDRICH J. Comparison of methods for the Fmoc solid-phase synthesis and cleavage of a peptide containing both tryptophan and arginine. 42(1):58-63. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1993.tb00350.x
9.
Roger E. 1994. Innovations & Perspectives in Solid Phase Synthesis. 3rd International Symposium; Birmingham pp. 251.: Mayflower Worldwide Ltd.
10.
Fields CG, Fields GB. 1993. Minimization of tryptophan alkylation following 9-fluorenylmethoxycarbonyl solid-phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 34(42):6661-6664. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)61669-6
11.
BECK-SICKINGER AG, SCHNORRENBERG G, METZGER J, JUNG G. Sulfonation of arginine residues as side reaction in Fmoc-peptide synthesis. 38(1):25-31. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1991.tb01405.x
12.
JAEGER E, REMMER HA, JUNG G, METZGER J, OBERTHÜR W, RÜCKNAGEL KP, SCHÄFER W, SONNENBICHLER J, ZETL I. 1993. Nebenreaktionen bei Peptidsynthesen, V. O-Sulfonierung von Serin und Threonin während der Abspaltung der Pmc- und Mtr-Schutzgruppen von Argininresten bei Fmoc-Festphasen-Synthesen. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 374(1-6):349-362. https://doi.org/10.1515/bchm3.1993.374.1-6.349
13.
Atherton E, Sheppard RC, Ward P. 1985. Peptide synthesis. Part 7. Solid-phase synthesis of conotoxin G1. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1.2065. https://doi.org/10.1039/p19850002065
14.
Pearson DA, Blanchette M, Baker ML, Guindon CA. 1989. Trialkylsilanes as scavengers for the trifluoroacetic acid deblocking of protecting groups in peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 30(21):2739-2742. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)99113-5
15.
Sole NA, Barany G. 1992. Optimization of solid-phase synthesis of [Ala8]-dynorphin A. J. Org. Chem.. 57(20):5399-5403. https://doi.org/10.1021/jo00046a022
16.
Guol L, FUNAKOSHI S, FUJII N, YAJIMA H. 1988. Studies on peptides. CLXV. Combination of a new amide-precursor reagent and trimethylsilyl bromide deprotection for the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl-based solid-phase synthesis of chicken antral peptide.. Chem. Pharm. Bull.. 36(12):4989-4992. https://doi.org/10.1248/cpb.36.4989
17.
Available from: https://www.febs.org/
18.
Rink H. 1987. Solid-phase synthesis of protected peptide fragments using a trialkoxy-diphenyl-methylester resin.. Tetrahedron Letters. 28(33):3787-3790. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)96384-6
19.
Giralt E, Andreu D. 1991. Peptides 1990, Proc. 21st European Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp. 419:
20.
Barlos K, Gatos D, Kallitsis J, Papaphotiu G, Sotiriu P, Wenqing Y, Schäfer W. 1989. Darstellung geschützter peptid-fragmente unter einsatz substituierter triphenylmethyl-harze. Tetrahedron Letters. 30(30):3943-3946. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)99290-6
21.
Barlos K, Gatos D, Kapolos S, Papaphotiu G, Schäfer W, Wenqing Y. 1989. Veresterung von partiell geschützten peptid-fragmenten mit harzen. Einsatz von 2-chlortritylchlorid zur synthese von Leu15 -gastrin I. Tetrahedron Letters. 30(30):3947-3950. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)99291-8
22.
Barlos K, et al. a. 1991. 2-cholorotrityl chloride resin. Int J Peptide Protein Res. 37513-520.
23.
Girald E, Andreu D. 1991. Peptides 1990, Proc. 21st European Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp. 131:
24.
Hodges SR, Smith AJ. 1994. Peptides, Chemistry, Structure & Biology. Proc. 13th American Peptide Symposium; ESCOM, Leiden pp. 157:
25.
Sieber P. 1987. A new acid-labile anchor group for the solid-phase synthesis of C-terminal peptide amides by the Fmoc method.. Tetrahedron Letters. 28(19):2107-2110. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)96055-6
26.
Smith AJ, Rivie EJ. 1992. Peptides, Chemistry & Biology, Proc. 12th American Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp. 525:
27.
Chan W, White P. 2000. Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach. 222. Oxford University Press, Oxford: pp. 218.
28.
Stewart MJ, Young DJ. 1984. Solid phase peptide synthesis. 2nd edition. Pierce Chemical Company, Rockford: pp. 91.
29.
Mellor S, et a. 2000. Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford University Press, Oxford: pp. 147-148.
30.
Ingenito R, Bianchi E, Fattori D, Pessi A. 1999. Solid Phase Synthesis of Peptide C-Terminal Thioesters by Fmoc/t-Bu Chemistry. J. Am. Chem. Soc.. 121(49):11369-11374. https://doi.org/10.1021/ja992668n
31.
Shin Y, Winans KA, Backes BJ, Kent SBH, Ellman JA, Bertozzi CR. 1999. Fmoc-Based Synthesis of Peptide-?Thioesters:  Application to the Total Chemical Synthesis of a Glycoprotein by Native Chemical Ligation. J. Am. Chem. Soc.. 121(50):11684-11689. https://doi.org/10.1021/ja992881j
32.
Biancalana S, et. a. 2001. Fmoc chemistry compatible thio-ligation assembly of proteins. Lett Pept Sci. 7291-297.
33.
Escher SE, Klüver E, Adermann K. 2001. 8(6):349-357. https://doi.org/10.1023/a:1016286204570
34.
Heidler P, Link A. 2005. N-Acyl-N-alkyl-sulfonamide anchors derived from Kenner?s safety-catch linker: powerful tools in bioorganic and medicinal chemistry. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 13(3):585-599. https://doi.org/10.1016/j.bmc.2004.10.045
35.
Quaderer R, Hilvert D. 2001. Improved Synthesis of C-Terminal Peptide Thioesters on ?Safety-Catch? Resins Using LiBr/THF. Org. Lett.. 3(20):3181-3184. https://doi.org/10.1021/ol016492h
36.
Patai S. 1975. The Chemistry of the hydrazo, azo and azoxy group Part 1. pp. 542: John Wiley & Sons, Ltd, Chichester.
37.
Millington CR, Quarrell R, Lowe G. 1998. Aryl hydrazides as linkers for solid phase synthesis which are cleavable under mild oxidative conditions. Tetrahedron Letters. 39(39):7201-7204. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(98)01543-3
38.
Peters C, Waldmann H. 2003. Solid-Phase Synthesis of Peptide Esters Employing the Hydrazide Linker. J. Org. Chem.. 68(15):6053-6055. https://doi.org/10.1021/jo034164k
39.
Kwon Y, Welsh K, Mitchell AR, Camarero JA. 2004. Preparation of Peptidep-Nitroanilides Using an Aryl Hydrazine Resin. Org. Lett.. 6(21):3801-3804. https://doi.org/10.1021/ol048417n
40.
Camarero JA, Hackel BJ, de Yoreo JJ, Mitchell AR. 2004. Fmoc-Based Synthesis of Peptide ?-Thioesters Using an Aryl Hydrazine Support?. J. Org. Chem.. 69(12):4145-4151. https://doi.org/10.1021/jo040140h
41.
Rosenbaum C, Waldmann H. 2001. Solid phase synthesis of cyclic peptides by oxidative cyclative cleavage of an aryl hydrazide linker?synthesis of stylostatin 1. Tetrahedron Letters. 42(33):5677-5680. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(01)01075-9
42.
Woo Y, Mitchell AR, Camarero JA. 2007. The Use of Aryl Hydrazide Linkers for the Solid Phase Synthesis of Chemically Modified Peptides. Int J Pept Res Ther. 13(1-2):181-190. https://doi.org/10.1007/s10989-006-9064-x
43.
Blanco-Canosa J, Dawson P. 2008. An Efficient Fmoc-SPPS Approach for the Generation of Thioester Peptide Precursors for Use in Native Chemical Ligation. Angew. Chem. Int. Ed.. 47(36):6851-6855. https://doi.org/10.1002/anie.200705471
44.
Harpaz Z, Siman P, Kumar KSA, Brik A. Protein Synthesis Assisted by Native Chemical Ligation at Leucine. Chem. Eur. J. of Chem. Bio.. 11(9):1232-1235. https://doi.org/10.1002/cbic.201000168
45.
Pentelute BL, Barker AP, Janowiak BE, Kent SBH, Collier RJ. 2010. A Semisynthesis Platform for Investigating Structure?Function Relationships in the N-Terminal Domain of the Anthrax Lethal Factor. ACS Chem. Biol.. 5(4):359-364. https://doi.org/10.1021/cb100003r
46.
Tiefenbrunn TK, Blanco-Canosa J, Dawson PE. Alternative chemistries for the synthesis of thrombospondin-1 type 1 repeats. Biopolymers. 94(4):405-413. https://doi.org/10.1002/bip.21486
47.
Woo J, Sigeizumi S, Yamaguchi K, Sugimoto K, Kobori T, Tsuji T, Kondo K. 1995. Peptidyl aldehyde derivatives as potent and selective inhibitors of cathepsin L. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 5(14):1501-1504. https://doi.org/10.1016/0960-894x(95)00236-m
48.
Nahm S, Weinreb SM. 1981. N-methoxy-n-methylamides as effective acylating agents. Tetrahedron Letters. 22(39):3815-3818. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(01)91316-4
49.
Fehrentz J, Paris M, Heitz A, Velek J, Liu C, Winternitz F, Martinez J. 1995. Improved solid phase synthesis of C-terminal peptide aldehydes. Tetrahedron Letters. 36(43):7871-7874. https://doi.org/10.1016/0040-4039(95)01646-y
50.
2000. N. J. Ede, et al. J. Pept. Sci., 6, 11.. https://doi.org/10.1002/(SICI)1099-1387(200001)6:1<11::AID-PSC229>3.0.CO;2-%23
Kapcsolódó protokollok
Kapcsolódó termékkategóriák
A folytatáshoz jelentkezzen be

Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.

Még nem rendelkezik fiókkal?