Ugrás a tartalomra
Merck

Szekvenálás

A DNS- vagy RNS-szálban lévő nukleinsavak összetételének és sorrendjének meghatározásának képessége mélyreható hatással van a modern genetika megértésére és számos olyan területre, amelyek nélkülözhetetlenek a betegségek kutatásához és az összes szervezet jobb megértéséhez. A nukleinsavak szekvenálásának képessége nemcsak egy szervezet genetikai kódjának megfejtéséhez hasznos, hanem további molekuláris technológiákkal kombinálva a kutatók számára hatékony eszközt biztosít a DNS-szekvenciák egyszerű manipulálásához és e változások szekvenálással történő ellenőrzéséhez. Mivel a kódoló DNS a fehérjék kódolt információjaként funkcionál, a kutatók ma már olyan rekombináns fehérjéket tervezhetnek testre szabottan, amelyek számos funkcionális elemet tartalmaznak, és amelyeket széles körben használnak ugyanilyen nagyszámú fontos kutatási kérdés megválaszolására. További teljes genom szekvenálási reagensek és útmutatókért látogasson el a Next-Generation Sequencing erőforrás.   

Sanger-szekvenálás

Régebben az analitikai kémiai módszerekkel meg lehetett határozni a nukleinsavak összetételét. Fred Sanger és munkatársai azonban olyan módszereket dolgoztak ki - kezdetben sugárzással jelölt emésztett fragmentumok és kétdimenziós frakcionálás segítségével -, amelyekkel az első teljes nukleinsekvenciák némelyikét sikerült előállítani. A terület fejlődése több évtizeden át folytatódott, és minden egyes fejlesztés a szekvenált fehérjék és genomok egyre növekvő könyvtárát gyarapította. E fejlesztések közé tartozik a nukleotidok hossz szerinti elválasztása gélelektroforézissel, majd kapilláris elektroforézissel. Emellett a fluoreszcensen jelölt nukleotidok beépítése és az egyes nukleinsavtöredékek automatizált számítógépes elemzése ma már a modern Sanger-szekvenálási módszert határozza meg.

DNS-szekvenálási módszertan

Míg a DNS-szekvenálási módszerek a technológia kezdete óta folyamatosan fejlődtek, számos alapvető összetevőre még mindig szükség van, és ezeket a modern DNS-szekvenáló platformok is használják. A DNS-előkészítés jellemzően magában foglalja a DNS izolálását és tisztítását a gazdaszervezetből. További kritikus komponenseket, köztük a szabad DNS-bázisokat, a DNS-primereket, a fluoreszcens címkéket tartalmazó módosított DNS-bázisokat (terminátor bázisok) és a DNS-polimerázt egyetlen edénybe adják össze. Az ezeket a komponenseket tartalmazó edényben egy sor fűtési és hűtési lépésen keresztül a teljes hosszúságú DNS-szekvenciához képest kis DNS-szekvenciákból álló könyvtárat állítanak elő, amelyek mindegyike fluoreszcens végcímkézett terminátor bázissal végződik. A fluoreszcensen végcímkézett nukleotidokat tartalmazó új DNS-szálakat hosszuk szerint szétválasztjuk, egy kapilláris csövön keresztül vezetjük, és méret szerint rendezzük. Ezután lézerrel gerjesztik a fluoreszcens bázist minden egyes szálon, miközben egy kamera rögzíti a jelet. Végül pedig egy számítógépet használnak általában arra, hogy az összegyűjtött információt a teljes hosszúságú DNS-szekvenciává állítsák össze.


Kapcsolódó műszaki cikkek

Kapcsolódó protokollok

További cikkek és protokollok keresése



A folytatáshoz jelentkezzen be

Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.

Még nem rendelkezik fiókkal?