Sanger szekvenálás lépései és módszere

Mi a Sanger-szekvenálás?

A Sanger-szekvenálás, más néven "láncvégződési módszer", a DNS nukleotidszekvenciájának meghatározására szolgáló módszer. A módszert a kétszeres Nobel-díjas Frederick Sanger és munkatársai fejlesztették ki 1977-ben, innen ered a Sanger-szekvencia elnevezés.

A DNS általános szerkezetének áttekintéséhez lásd 2. ábra.

Hogyan működik a Sanger-szekvenálás?

A Sanger-szekvenálás végezhető manuálisan vagy - ami a leggyakoribb - automatizált módon, szekvenálógépen keresztül (1. ábra). Mindegyik módszer három alapvető lépést követ, amelyeket az alábbiakban ismertetünk.

1. ábra. Az automatizált Sanger-szekvenálás három alapvető lépése.

Sanger szekvenálás lépései

A Sanger szekvenálásnak három fő lépése van.

1. DNS-szekvencia a láncvégződéses PCR-hez

Az érdeklődésre számot tartó DNS-szekvencia sablonként szolgál egy speciális típusú PCR úgynevezett láncvégződéses PCR. A láncvégződéses PCR ugyanúgy működik, mint a standard PCR, de egy lényeges különbséggel: módosított nukleotidok (dNTP-k), úgynevezett dideoxiribonukleotidok (ddNTP-k) hozzáadásával. A standard PCR hosszabbítási lépése során a DNS-polimeráz dNTP-ket ad a növekvő DNS-szálhoz azáltal, hogy foszfodiészterkötés kialakulását katalizálja az utolsó nukleotid szabad 3'-OH csoportja és a következő 5'-foszfátja között (2. ábra).

A láncvégződéses PCR-ben a felhasználó a PCR-reakcióban a normál dNTP-khez kis arányban kever láncvégződéses ddNTP-ket. A ddNTP-kből hiányzik a foszfodiészterkötés kialakításához szükséges 3'-OH csoport; ezért amikor a DNS-polimeráz véletlenszerűen beépít egy ddNTP-t, a hosszabbítás megszűnik. A láncvégződéses PCR eredménye az érdeklődésre számot tartó DNS-szekvencia több millió-milliárd oligonukleotid-kópiája, amelyet 5'-ddNTP-vel véletlenszerű hosszúságban (n) fejeznek be.

A manuális Sanger-szekvenálás során négy PCR-reakciót állítanak be, amelyek mindegyikébe csak egyféle ddNTP-t (ddATP, ddTTP, ddGTP és ddCTP) kevernek.

A automatizált Sanger-szekvenálásban az összes ddNTP-t egyetlen reakcióban keverik össze, és a négy dNTP mindegyike egyedi fluoreszcens jelöléssel van ellátva.

2. Méret szerinti szétválasztás gélelektroforézissel

A második lépésben a láncvégződésű oligonukleotidokat gélelektroforézissel méret szerint választjuk szét. A gélelektroforézis során a DNS-mintákat egy gélmátrix egyik végébe töltik, és elektromos áramot alkalmaznak; a DNS negatív töltésű, így az oligonukleotidok a gél ellentétes oldalán lévő pozitív elektróda felé húzódnak. Mivel minden DNS-darab tömegegységenként azonos töltéssel rendelkezik, az oligonukleotidok mozgásának sebességét csak a méret határozza meg. Minél kisebb egy fragmentum, annál kisebb súrlódás éri, amikor a gélen keresztül mozog, és annál gyorsabban fog mozogni. Ennek eredményeképpen az oligonukleotidok a legkisebbtől a legnagyobb felé haladva, a gélt alulról felfelé olvasva helyezkednek el.

A manuális Sanger-szekvenálás során a négy PCR-reakcióból származó oligonukleotidokat a gél négy külön sávjában futtatjuk. Ez lehetővé teszi a felhasználó számára, hogy tudja, hogy melyik oligonukleotidok melyik ddNTP-nek felelnek meg.

A automatizált Sanger-szekvenálásban az összes oligonukleotidot egyetlen kapilláris gélelektroforézisben futtatják a szekvenálógépen belül.

3. Gélelemzés & A DNS-szekvencia meghatározása

Az utolsó lépés egyszerűen a gél leolvasása a bemeneti DNS szekvenciájának meghatározásához. Mivel a DNS-polimeráz csak 5' és 3' irányban szintetizál DNS-t egy megadott primerrel kezdve, minden egyes terminális ddNTP egy adott nukleotidnak felel meg az eredeti szekvenciában (pl, a legrövidebb fragmentumnak az 5' végétől számított első nukleotidnál kell végződnie, a második legrövidebb fragmentumnak az 5' végétől számított második nukleotidnál kell végződnie stb.) Ezért a gélsávok legkisebbtől a legnagyobbig történő leolvasásával meghatározhatjuk az eredeti DNS-szál 5' és 3' közötti szekvenciáját.

A manuális Sanger-szekvenálás során a felhasználó a gél mind a négy sávját egyszerre olvassa le, alulról felfelé haladva, és a sávok segítségével meghatározza az egyes sávok terminális ddNTP-jének azonosságát. Ha például az alsó sávot a ddGTP-nek megfelelő oszlopban találjuk, akkor a legkisebb PCR-fragment ddGTP-vel végződik, és az eredeti szekvencia 5' végétől számított első nukleotid guanin (G) bázisú.

A automatizált Sanger-szekvenálásban a számítógép a kapilláris gél minden egyes sávját sorrendben leolvassa, és a fluoreszcencia segítségével minden egyes terminális ddNTP azonosságát megadja. Röviden, egy lézer gerjeszti az egyes sávokban lévő fluoreszcens címkéket, és a számítógép érzékeli az így kibocsátott fényt. Mivel a négy ddNTP mindegyike más-más fluoreszcens jelöléssel van ellátva, a kibocsátott fény közvetlenül a terminális ddNTP azonosságához köthető. A kimenetet kromatogramnak nevezzük, amely az egyes nukleotidok fluoreszcens csúcsát mutatja a sablon DNS hossza mentén.

2. ábra. A DNS szerkezetének vázlata. A DNS egy molekula, amely két szálból áll, amelyek egymás köré tekeredve kettős spirált alkotnak. Mindkét szál dezoxiribonukleotidoknak (dNTP-k) nevezett molekulákból áll.

Minden dNTP tartalmaz egy foszfátcsoportot, egy cukorcsoportot és a négy nitrogénbázis [adenin (A), timin (T), guanin (G) vagy citozin (C)] egyikét. A dNTP-ket az egyik dNTP cukorcsoportja és a következő dNTP foszfátcsoportja közötti foszfodiészter kovalens kötések fűzik egymáshoz lineárisan; ez az ismétlődő cukor-foszfát minta alkotja a cukor-foszfát gerincet.

A két különálló szál nitrogénbázisai a komplementer bázisok közötti hidrogénkötésekkel kapcsolódnak egymáshoz, így alakul ki a kettős szálú DNS-helix.

Hogyan olvassuk le a Sanger-szekvenálás eredményeit

A Sanger-szekvenálás eredményeinek megfelelő leolvasása attól függ, hogy a két komplementer DNS-szál közül melyik az érdekes, és milyen primer áll rendelkezésre. Ha a két DNS-szál A és B, és az A szál az érdekes, de a primer jobb a B szálhoz, akkor a kimeneti fragmentumok az A száléval lesznek azonosak. Másrészt, ha az A szál az érdekes, és a primer jobb az A szálhoz, akkor a kimeneti fragmentumok a B száléval lesznek azonosak. Ennek megfelelően a kimenetet vissza kell konvertálni az A szálra.

Ha tehát az érdekes szekvencia "TACG", és a primer erre a szálra a legjobb, akkor a kimenet "ATGC" lesz, és ezért vissza kell konvertálni "TACG"-re. Ha azonban a primer a komplementer szálhoz ("ATGC") jobb, akkor a kimenet "TACG" lesz, ami a helyes szekvencia.

Röviden, mielőtt elkezdenénk, tudnunk kell, hogy mit akarunk elérni, és hogyan fogunk oda eljutni! Tehát ezt szem előtt tartva, íme egy példa az előbbi példára (TACG -> ATGC -> TACG). Ha a dideoxinukleotidok jelölése T = sárga, A = rózsaszín, C = sötétkék és G = világoskék, akkor a primer-A, primer-AT, primer-ATG és primer-ATGC rövid szekvenciákat kapja. Miután a fragmentumokat elektroforézissel szétválasztottuk, a lézer a fragmentumokat hosszuk sorrendjében (rózsaszín, sárga, világoskék és sötétkék) fogja leolvasni, és kromatogramot készít. A számítógép átalakítja a betűket, így a végső szekvencia a helyes TACG lesz.

Sanger-szekvenálás vs. PCR

A Sanger-szekvenálás és a PCR hasonló kiindulási anyagokat használ, és együtt is használhatók, de egyik sem helyettesítheti a másikat.

A PCR a DNS teljes egészében történő felerősítésére szolgál. Bár véletlenül különböző hosszúságú fragmentumok keletkezhetnek (pl. a DNS-polimeráz leeshet), a cél a teljes DNS-szekvencia megkettőzése. Ennek érdekében a "hozzávalók" a cél-DNS, a nukleotidok, a DNS-primer és a DNS-polimeráz (különösen a Taq-polimeráz, amely képes túlélni a PCR-hez szükséges magas hőmérsékletet).

A Sanger-szekvenálás célja ezzel szemben a DNS minden lehetséges hosszának előállítása a cél-DNS teljes hosszáig. Ezért van szükség a PCR kiindulási anyagai mellett a dideoxinukleotidokra is.

A Sanger-szekvenálás és a PCR összehozható a Sanger-szekvenálási protokoll kiindulási anyagának előállítása során. A PCR segítségével a szekvenálandó DNS több példányát lehet létrehozni.

Azzal, hogy több mint egy templátból dolgozhatunk, hatékonyabbá válik a Sanger-protokoll. Ha a célszekvencia 1000 nukleotid hosszú, és a sablonból csak egy példány van, akkor az 1000 jelölt fragmentum előállítása hosszabb időt vesz igénybe. Ha azonban a templátnak több példánya van, elméletileg kevesebb időbe telik mind az 1000 jelölt fragmentum előállítása.