Western blot analýza imunoprecipitace (IP-Western)

IP-Western analýza zůstává oblíbenou technikou pro identifikaci interakcí protein-protein a identifikaci neznámých proteinů ve víceproteinovém komplexu. Jednotlivé kroky zahrnují lýzu buněk, tvorbu komplexu protilátka-antigen (imunokomplex), precipitaci imunokomplexů a analýzu pomocí Western blotu.

Přečtěte si více informací

• Vysoké pozadí
• Nevyloučí se žádný cílový protein nebo se nevyloučí dostatečné množství cílového proteinu
• Extra pás(y) na 50 kDa a 20 kDa na finálním Western Blotu, který může maskovat pás zájmu
• Průvodce výběrem imunoprecipitačních kuliček

Vysoké pozadí

Obrázek 1. Vysoké pozadí, které vede k nespecifickým pásům na Western blotu.

Možná příčina	Náprava
Nespecifická vazba na kuličky	Při použití agarosových kuliček proveďte krok předběžného vyčištění. Přidáním nepotažených agarózových kuliček (před přidáním kuliček potažených protilátkou) do směsi proteinů odstraníte proteiny, které se nespecificky vážou na agarózu. Před přidáním protilátky zajistěte, aby byly kuličky řádně zablokovány BSA. Zmenšete objem kuliček.
Promývací pufr není dostatečně přísný	Přejděte na pufr s vyšší přísností, například na bázi RIPA.
Nespecifická vazba protilátek	Snižte inkubační dobu, objem/koncentraci lyzátu a/nebo koncentraci protilátek. Použijte specifičtější protilátku.
Neadekvátní promývání	Přidejte více promývání a/nebo promývejte delší dobu. Zvýšit přísnost promývacího pufru. Několikrát invertovat zkumavku, aby se zajistilo dostatečné promývání.

Nevyloučil se žádný cílový protein nebo se nevyloučil dostatečný počet cílových proteinů

Možná příčina	Náprava
Degradace, defosforylace a denaturace bílkovin během kroku lyzace	Všechny kroky provádějte při teplotě 4 °C. Zajistěte dostatečné množství inhibitorů proteáz a fosfatáz.
Příliš přísný lyzační pufr	Přejděte na pufr se střední nebo nízkou přísností, například na bázi NP-40, Triton® X-100 nebo PBS.
Protilátka nenavázaná na kuličky	Ujistěte se, že jsou kuličky správně přizpůsobeny izotypu protilátky.
Nedostatečná vazba protilátky a antigenu	Zvýšit koncentraci protilátky přidané do směsi lyzátu a/nebo koncentraci kuliček. Inkubujte směs protilátky a lyzátu delší dobu.  V případě nízké koncentrace bílkovin nebo nízké afinity protilátka-protein přejděte z metody přímé imunoprecipitace na nepřímou metodu.
Agarózové kuličky náhodně odstraněné během precipitačního kroku	Zajistěte, aby agarózové kuličky nebyly nasáty do pipety. Použijte magnetické kuličky místo agarózových kuliček, abyste minimalizovali/eliminovali ztrátu kuliček.
Myší IgG nebo kuřecí protilátka se neúčinně váže na kuličky konjugované s proteinem G nebo proteinem A (pro nepřímou imunoprecipitaci)	Přidejte přemosťující protilátku během precipitačního kroku, abyste zlepšili vazbu těchto protilátek na kuličky konjugované s proteinem G nebo proteinem A. Přidejte přemosťující protilátku během precipitačního kroku, abyste zlepšili vazbu těchto protilátek na kuličky konjugované s proteinem G nebo proteinem A.
Cílový protein zůstává na kuličkách	Zajistěte vhodný typ elučního pufru a pH.
Narušení proteinových komplexů (při koimunoprecipitačních experimentech)<./td>	Vortexujte jemně a používejte široké pipetovací špičky, abyste zabránili narušení proteinových komplexů.

Pás(y) navíc při 50 kDa a 20 kDa na finálním Western Blotu, které mohou maskovat zajímavý pás

Obrázek 2. Při síťování IP westernu jsou ze vzorku vyloučeny těžké a lehké řetězce primární záchytné protilátky.

Možná příčina	Napravení
Těžké a lehké řetězce primární protilátky jsou rozpoznávány sekundární protilátkou./td>	Použijte sekundární protilátku, která detekuje nativní (nedenaturované) imunoglobuliny. Použijte síťovací IP tak, že nejprve zesíťujete kuličky proteinu A nebo G se záchytnou protilátkou pomocí DSS

Průvodce výběrem imunoprecipitačních kuliček

Relativní afinita

Protilátky	Směs proteinů A/G	Protein A	Protein G	Protein G/span>	Kappa Ig Binder	Lambda Ig Binder	Kappa/Lambda Mix*
Králičí IgG	SA	SA	SA
Myší IgM	RE	SA
Myší IgG3	SA	MSA	SA
Myší IgG2b	SA	SA	SA
Myší IgG2a	SA	SA	SA
Myší IgG1	MSA	MSA	MSA
Lidský IgM	MSA	MSA		MSA	MSA	SA
Human IgE	MSA	MSA		MSA	MSA	SA
Lidský IgD	MSA	MSA		MSA	MSA	SA
Lidský IgA	MSA	MSA		MSA	MSA	MSA<./td>	SA
Lidský IgG4	SA	SA	A	SA	MSA	MSA	SA
Human IgG3	SA		SA	MSA	MSA	SA
Human IgG2	SA	SA	SA	MSA	MSA	MSA	SA
Lidský IgG1	SA	SA	SA	SA	MSA	MSA	SA
Potkan IgM	RE	RE
Potkan IgG2c	MSA	RE	MSA
Potkan IgG2b	MSA	RE	MSA
Potkan IgG2a	SA	RE	SA
Potkan IgG1	MSA	RE	MSA
Rat IgG	MSA	SA	SA

Fragmenty	Směs bílkovin A/G	Bílkoviny A	Protein G	Kappa Ig pojivo	Lambda Ig pojivo	Kappa/Lambda Mix*
Lidský l						SA	MSA
Člověk k				SA		MSA
Human Fc	MSA	MSA	MSA
Člověčí scFv	MSA	Př.MSA		RE	RE	RE
Člověk F(ab')2	MSA	MSA	MSA	MSA	MSA	MSA	SA
Člověk F(ab)	MSA	Sa	MSA	MSA	MSA	SA
Klíčový kód pro relativní afinitu proteinů A a G; magnetické kuličky PureProteome™ Kappa a Lambda pro protilátky: SA = silná afinita; MSA = střední/slabá afinita; RE = vyžaduje hodnocení *Směs PureProteome™ Kappa/Lambda není katalogovou položkou. Stačí si pořídit kuličky Kappa a Lambda samostatně a smíchat je v poměru 1:1.