Kontrolní náplně pro Western Blotting
Chandra Mohan, Ph.D., Wayne Speckmann, Ph.D, Robin Clark, Ph.D
Od první publikace popisující Western blotting (Renart et al., 1979) je tato imunodetekční technika široce využívána k identifikaci specifických proteinů v komplexních směsích extrahovaných z buněk nebo tkání. Western blotting má tři základní prvky:1 separace proteinů podle jejich velikosti,2 přenos na pevný nosič a3 označení cílových proteinů pomocí vhodné primární protilátky s následnou vizualizací, obvykle pomocí konjugované sekundární protilátky. Následné zdokonalení nástrojů a technik - spolu s vývojem vysoce citlivých fluorescenčních značek - významně zvýšilo limity detekce, a umožnilo vědcům zkoumat tkáňově specifické normální a chorobné dráhy. Při použití kvantitativního Western blotu k identifikaci změn hladin proteinů se však vědci obvykle potýkají s určitými obtížemi. Důvodem je skutečnost, že mnoho proteinů vykazuje v různých tkáních a za různých fyziologických a patologických podmínek různé vzorce exprese.
Western blotting: rutinní technika, která není jednoduchá
Ačkoli je Western blotting pravděpodobně nejčastěji používanou imunoaplikací, stále existuje několik kritických technických problémů, které mohou být chronicky přehlíženy. Například ovlivňují izolační nebo separační protokoly integritu proteinu nebo jeho posttranslační modifikaci? Lze rozlišit degradace nebo agregace proteinů od příslušných produktů biologických procesů? Když je výsledkem více pásů, jak lze určit, které jsou výsledkem, variací, artefaktem? (Gorr a Vogel, 2015)
Kvantitativní Western blot lze použít k porovnání relativního množství cílového proteinu mezi skupinou vzorků, které mohou představovat různé jedince, léčebné podmínky, chorobné stavy nebo jiné biologické proměnné. K přesné identifikaci a měření celkových hladin proteinů ve více vzorcích mohou vědci použít "kontroly zatížení" jako vnitřní standardy. Tato kontrola znamená přidání primární protilátky proti proteinu, o němž se předpokládá, že je přítomen ve všech vzorcích a jehož relativní množství není ovlivněno biologickými odchylkami nebo experimentálními podmínkami. Proteinové cíle, které jsou obvykle vhodnými kandidáty na kontrolu načítání, jsou všudypřítomně exprimované "domácí" genové produkty. Použití kontrol zatížení umožňuje kvantifikaci zatížení vzorku ve všech jamkách za účelem normalizace výsledků za předpokladu, že kontrola zatížení je v různých vzorkovacích drahách stejná. Použití kontrol zatížení také chrání před "efektem okraje", což je stav, který se běžně vyskytuje, když se použije velký počet drah a proteiny ve vnějších drahách se přenesou na membránu v poloze blíže k rámu, což způsobí intenzivnější barvení na okraji blotu. Kontroly zatížení lze použít k prokázání toho, zda došlo k odchylkám v zatížení proteinů, a mohou být příčinou pozorovaných odchylek v cílovém pásu (cílových pásech). Při správném použití kontroly načítání zajišťují, že proteiny jsou správně kvantifikovány i přes nepatrné rozdíly v množství načítání ve všech drahách Western blotu.
Western blot validace monoklonální protilátky proti β-aktinu (A5316). Konstitutivně exprimované proteiny, jako je β-aktin, β-tubulin, GAPDH a další, se často volí jako kontrola zatížení pro kvantitativní Western blotting. Použití kontrol zatížení pomáhá zajistit, že zjevné rozdíly v množství cílových proteinů jsou způsobeny příslušnými biologickými odchylkami, a nikoli nesrovnalostmi v množství celkového proteinu, který se na gel načítá. Níže uvedená tabulka uvádí další protilátky specifické pro vzorek a podmínky, které jsou užitečné jako kontroly zatížení WB.
Výběr kontrolních protilátek
Beta-aktin a beta-tubulin se důsledně používají jako kontrolní protilátky, protože jejich exprese je ve většině modelových systémů relativně konstitutivní. Některé publikace však zpochybňují oprávněnost použití β-aktinu jako standardní kontroly zatížení (Ditmar a Ditmar, 2006; Eaton et al., 2013; Li a Shen, 2013) s odůvodněním, že hladiny β-aktinu a β-tubulinu se v jednotlivých tkáních liší, a jejich exprese může být ovlivněna patologickými stavy. Autoři těchto publikací navrhují jako alternativní techniku při kvantitativním Western blottingu analýzu celkových proteinů, a doporučují, aby se produkty "housekeepingových" genů používaly opatrně po prostudování vzorce exprese zkoumaného genu. Nicméně β-aktin a β-tubulin nabízejí určité výhody jako kontrolní vzorky: jsou vysoce konzervované, vykazují vysokou úroveň exprese a jsou stabilní za většiny experimentálních podmínek. Je důležité si uvědomit, že je třeba zvolit kontrolu na základě specifické tkáně nebo typu studované buňky a že k ověření jednotnosti kontroly zatížení může být zapotřebí empirické testování.
Tipy pro získání efektivních výsledků z kontrolních protilátek
K překonání variability při Western blottingu a snížení chyb při interpretaci dat, mohou být užitečná některá z následujících opatření.
- Používejte interní kontroly zatížení, které jsou stabilně exprimovány a jsou minimálně ovlivněny experimentálními podmínkami.
- Vyberte kontrolní protilátku proti proteinu, o kterém je známo, že je ve vašem vzorku konstitutivně exprimován.
- Používejte druhou kontrolu zatížení k doložení výsledků získaných pro první kontrolu. To se může vyplatit zejména u nových nebo neotřelých vzorků.
- Kontrola načítání by měla pokrývat široký rozsah molekulových hmotností, aby zvolená kontrola byla v podobném rozsahu MW, ale ne stejném MW jako cílový protein. To zajistí, že na blotu lze snadno rozlišit cílové i kontrolní pásy.
- Základní kontrolní protilátky často detekují housekeepingové proteiny, které jsou hojně exprimovány, což vede k saturaci signálu, zejména při použití chemiluminiscenční detekční metody. Přesycení může způsobit, že pásy kontroly zatížení nebudou použitelné pro referenční účely, mohou skrývat rozdíly v množství cílového proteinu mezi jednotlivými vzorky.
Před zahájením měření zkontrolujte koncentraci protilátek a dobu expozice kontroly zatížení se vzorkem, který má být použit, abyste se ujistili, že signál kontroly zatížení je v lineárním rozsahu detekce.
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?