Test imunoprecipitačního čipu RNA (RIP)

Interakce mezi proteiny a RNA hrají v buňce důležitou roli, včetně strukturních, katalytických a regulačních funkcí. Podobně jako chromatinovou imunoprecipitaci (ChIP) lze RNA imunoprecipitaci (RIP) použít k detekci asociace jednotlivých proteinů se specifickými nukleovými kyselinami, jako jsou mRNA, nekódující RNA (např. dlouhé nekódující RNA, enhancerové RNA, miRNA) a virové RNA. Existují dvě hlavní varianty testu RIP: nativní a zesíťovaný. Nativní RIP test umožňuje přímou identifikaci navázaných RNA na protein zájmu a jejich množství v imunoprecipitovaném vzorku. Zatímco zesíťované testy RIP umožňují přesné zmapování přímého a nepřímého vazebného místa proteinu a RNA (obrázek 1). Při zesíťovaném RIP se živé buňky ošetřují vysoce reaktivním formaldehydem, aby se vytvořily reverzibilní zesíťované vazby protein-RNA mezi molekulami, které jsou v těsné blízkosti in vivo (obrázek 2).

Obrázek 1. Srovnání nativního a zesíťovaného materiálu Zatímco k analýze RNA asociované s chromatinem se používají jak nativní, tak zesíťované přístupy, nativní přístup RIP (pravý panel) obvykle umožňuje obnovit vysoce afinitní interakce protein-RNA. Naopak metoda se zesíťovanou vazbou (pravý panel) je navržena tak, aby zachytila komplexy s vyšší molekulovou hmotností a snadněji zachytila slaběji interagující RNA.

https://www.emdmillipore.com/US/en/product/EZ-Magna-RIP-RNA-Binding-Protein-Immunoprecipitation-Kit,MM_NF-17-701RNA imunoprecipitace (RIP) Pracovní postup protokolu testu

Protokol, který zvolíte pro svůj test RIP, bude částečně určen místem vazby proteinu a DNA (cytoplazma nebo jádro). Obecný protokol RIP z celobuněčného lyzátu může být nejvhodnější pro interakce v cytoplazmě, zatímco jaderný protokol RIP může být optimální pro interakce probíhající v jádře. Pokud neexistují žádné stávající znalosti o umístění vazebných RNA, lze použít obecný protokol RIP z nativního celobuněčného lyzátu (obrázek 2A) (17-700, 17-701) se doporučuje zlepšit možnost imunoprecipitace vazebných RNA bez ohledu na jejich umístění. Tento protokol pracuje s různým množstvím a typem výchozího materiálu, jako jsou buňky a vzorky tkání. Pokud je známo, že se vazebné RNA vyskytují v jádře nebo jsou spojeny s chromatinem, lze použít jaderný nativní (17-10522, 17-10523) nebo síťovaný protokol RIP (17-10520, 17-10521) se doporučuje. Tyto protokoly namísto imunoprecipitace RNA z lyzátu celých buněk provádějí imunoprecipitaci na izolovaných jádrech, což umožňuje lepší poměr signálu k šumu.

Ačkoli jsou tyto protokoly určeny pro imunoprecipitaci všech typů RNA, existují dva další protokoly speciálně vyvinuté pro identifikaci a analýzu oblastí chromatinu, které interagují se specifickými dlouhými nekódujícími RNA asociovanými s chromatinem/Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (obrázek 2B) (17-10494, 17-10495) nebo transkriptomové profilování míst metylace m6A (N6-methyladenosinu) RNA (obrázek 2C) (17-10499).

Obrázek 2. Pracovní postupy různých protokolů RIP A. Pracovní postup RIP s nativním lyzátem celých buněk (č. produktu 17-700, 17-701) B. Pracovní postup ChIRP (č. produktu 17-10494, 17-10495) C. Pracovní postup RIP s m6A (č. produktu 17-10499)

Následné analýzy protokolu RIP (Assay protocol workflow)

RNA izolované po dokončení protokolu RIP lze analyzovat několika molekulárními metodami včetně koncové RT-PCR a kvantitativní RT-PCR (pokud jsou známy vazebné cíle RBP), mikroarray nebo metodami hloubkového sekvenování (obrázek 3). Vzhledem k cíli RNA se známou sekvencí lze navrhnout genově specifické primery, které umožňují ověření (a kvantifikaci) imunoprecipitované RNA. Jakmile je potvrzena úspěšná RIP, lze pokračovat v dalším zkoumání populace RNA v imunoprecipitaci metodami založenými na populaci, jako je srovnávací hybridizace výsledných cDNA na mikroarray nebo hloubkové sekvenování molekulárně upravených produktů z RIP. Níže jsou uvedeny ilustrativní metody pro provedení koncového kvantitativního měření nebo analýzy NGS experimentů RIP v reálném čase.

Obrázek 3. Analýzy RIP RNA pomocí qRT-PCR

A. RIP Lyzát připravený z HeLa buněk (2x10⁷ buněčných ekvivalentů na IP) byl podroben imunoprecipitaci s použitím 5 µg buď normálního myšího IgG, nebo protilátky anti-PABPC1 a soupravy Magna RIP Kit (č. výrobku 17-700). Úspěšná imunoprecipitace RNA asociované s PABPC1 byla ověřena pomocí qRT-PCR s použitím primerů RIP, ACTB.

B.RIP Lyzát připravený z buněk HeLa (0,5 × 10⁶ nebo 1.7 × 10⁶ buněčných ekvivalentů na IP) byl imunoprecipitován pomocí 2,5 μg normální králičí protilátky IgG nebo protilátky Anti-HUR a sady pro imunoprecipitaci RNA Imprint (RIP). Imunoprecipitace cílové a necílové RNA spojené s HUR byla ověřena pomocí qPCR s použitím kontrolních primerů Actin B a JUN.

C. LincSFPQ asociovaný s komplexem PRC2 (EZH2 a SUZ12) a U1snRNA (negativní), v buňkách HeLa byl analyzován pomocí qRT-PCR s Magna Nuclear RIP zesíťovaným (produkt č. 17-10520). Výkony poměru signálu k šumu byly porovnány s konkurenční soupravou.

D a E. Magna Nuclear RIP Assay s pouhými 5 000 (zesíťované, produkt č. 17-10520) a 100 000 (Native, produkt č. 1) (např. 17-10522). Buňky: V případě, že se jedná o buňky, které se nacházejí na území České republiky, je možné, že se jedná o buňky, které se nacházejí na území České republiky. Údaje o citlivosti ukazující, že obohacení NEAT1 pomocí crosslink protokolu bylo prokázáno s 5 000 buňkami HeLa, zatímco u nativních metod bylo zapotřebí 100 000 buněk (C). Údaje o poměru signály a šumu ukazující, že celkový poměr pozitivních a negativních výsledků nativního protokolu byl vyšší (D).

F.  MeRIP (kat. č.: 17-10499) byl proveden s použitím celkové RNA z buněk HEK293. Purifikovaná RNA byla poté analyzována pomocí RT-qPCR s použitím pozitivních kontrolních primerů (MeRIP Primers Human EEF1A1 Positive, č. výrobku CS220017) a negativních kontrolních primerů (MeRIP Primers Human EEF1A1 Negative, č. výrobku CS220018).

G. Levý panel: úspěšné získání metylované RNA pomocí testu MeRIPTMm6A s mRNA z různých buněk. Metoda MeRIP (č. výrobku 17-10499) byla provedena s použitím mRNA z buněk lidského předkožkového fibroblastu bez xenu (HFF, č. výrobku SCC058), buněk lidského dlaždicového karcinomu hlavy  krku UM-SCC-104 (č. výrobku SCC072) a lidských embryonálních kmenových buněk (H9). Purifikovaná RNA byla poté analyzována pomocí RT-qPCR s použitím pozitivních kontrolních primerů (MeRIP Primers Human EEF1A1 Positive, Product No. CS220017) a negativních kontrolních primerů (MeRIP Primers Human EEF1A1 Negative, Product No. CS220018). Střední a pravý panel: Analýza hladin m6A RNA reprogramovacích genů v myších a lidských ES buňkách. MeRIP (č. produktu 17-10499) byla provedena s použitím mRNA z myších ES buněk PluriStem 129/S6 (č. produktu SCR012) a lidských ES buněk H9. Purifikovaná RNA byla poté analyzována pomocí RT-qPCR s použitím primerů MeRIP m6A peak pro Myc, Sox2, Nanog, Klf4 a Oct4. Sekvence PCR primerů pro myší reprogramovací geny poskytl Howard Chang (Stanford University). Lidské primery PCR byly navrženy na základě publikovaných dat MeRIP-Seq. Jednokroková RT-qPCR byla provedena pomocí přístroje Bio-Rad qPCR a souprav iTaq™ Universal One-Step Kits (Bio-Rad). Procentuální výtěžnost vstupního vzorku byla vypočtena pomocí standardní křivky nakreslené s 0,1 % vstupního vzorku nebo metodou delta delta Ct.

H. ChIRP (č. produktu 17-10494) byla provedena s použitím lyzátu buněk HeLa a buď sady sond Magna ChIRP TERC lncRNA Probe Set even odd (č. produktu 03-309) nebo NEAT1 lncRNA Probe Set even odd (Product No. 03-308)nebo Magna ChIRP Negative Control Probe Set (LacZ) (produkt č. 03-307). Purifikovaná RNA byla poté analyzována pomocí qRT-PCR s použitím polymerů pozitivní kontroly RNA (TERC nebo NEAT1) a polymerů negativní kontroly RNA (GAPDH).

RIP RNA analyzovaná pomocí sekvenování nové generace (RIP-seq)

.

Obrázek 4. Analýza RIP-Seq byla provedena s EZH2 a SUZ12 v buňkách HeLa pomocí jaderné nativní RIP soupravy Magna (č. produktu 17-10522) nebo jaderné zesítěné RIP soupravy Magna (č. produktu 17-10520). Data ukázala obohacené signály u transkriptů NEAT1 (A, horní panel) a lincRNA HOTAIR (B. střední a dolní panel).

Obrázek 5. Sekvenační analýza nové generace DNA pull-down pomocí soupravy Magna ChIRP

ChIRP byla provedena na lyzátu buněk HeLa. Biotinylované záchytné oligo (Magna ChIRP™ NEAT1 lncRNA Probe Set (odd and even pools) (Product No. 03-308)) a negativní kontrolní sondy (Magna ChIRP™ Negative Control Probe Set (LacZ) Product No. 03-307) byly použity pro pull down reakce. Sekvenční knihovny byly sekvenovány na přístroji HiSeq (Illumina). Sekvenční čtení byla zarovnána k referenčnímu genomu (hg19) pomocí Bowtie. (a) Vrcholy byly vyvolány zvlášť pomocí dat ze sudých a lichých sad sond. K tomuto účelu lze použít algoritmy jako MACS. Ty společné byly považovány za platné píky. (b) Byla provedena řada kroků zpracování a filtrování po zarovnání pomocí analytického softwaru dostupného v laboratoři Howarda Changa (https://changlab.stanford.edu/protocols.html). Data ukazující lokalizaci RNA NEAT1 do oblasti genu NEAT1 a další příkladové oblasti (c).

Často kladené otázky k RIP, tipy pro řešení problémů a příručka pro analýzu dat

Při provádění experimentů RIP se můžete setkat s některými problémy, jako je například absence imunoprecipitace RNA nebo vysoké pozadí či nízký poměr signálu k šumu. Níže uvedené informace vám mají pomoci získat dostatečné znalosti o této technice ještě před jejím zahájením; poskytnout tipy, když experimenty nefungují, a provést vás analýzou dat.

• Časté dotazy k RIP celého buněčného lyzátu
• Tipy pro řešení problémů při RIP celého buněčného lyzátu
• Tipy pro řešení problémů při izolaci chromatinu purifikací RNA (ChIRP)
• Troubleshooting tips for MeRIP
• Krátký protokol RIP-qPCR
• RIP-qRT-PCR:

  Která souprava RIP je pro vás ta pravá?

  Celobuněčný lyzát RIP

Název výrobku	Výrobek č.	Highlights
Sada pro imunoprecipitaci proteinů vážících RNA RIP™./td>	17-700	Podrobný popis produktu1) Navrženo k dotazování interakcí mezi různými druhy RNA, jako jsou mRNA, miRNA a lncRNA, s jejich vazebnými proteiny, většinou v ribozomu, cytoplazmě a rozpustné části jádra 2) 484 citací
Sada pro imunoprecipitaci RNA-vázajících proteinůEZ-Magna RIP™	17-701	1) Stejný design jako 17-700 s přidáním kontrolní protilátky a kontrolního primeru 2) 156 citací
Souprava pro imunoprecipitaci RIP™ Quad RNA-Binding Protein Kit	17-704	čtyřnásobek 17-700
Imprint®	RIP-12RXN	1) Obsahuje dva lyzační pufry, jeden mírný pro méně pevně vázané RNP, druhý drsný pro silně vázané RNP. 2) 15 citací
Magna GrIP™ Rack (8 jamek)	.20-400	Polyethylenový stojan obsahující 4 neodiniové magnety, který se používá pro testy ChIP a RIP

Jaderný RIP (křížový a nativní)

Název produktu	Číslo produktu.	Highlights
Sada pro imunoprecipitaci jaderného RIP™ (zesíťovaného) proteinu vážícího jadernou RNA	17-10520	1) Zachycení různých RNA spojených s chromatinem, jako jsou dlouhé nekódující RNA, enhancerové RNA a miRNA, z milionů buněk nebo jen z 5 000 buněk 2) mnohem nižší pozadí a vysoký poměr signál/šum 3) Zesíťovaný protokol může zachytit komplexy s vyšší molekulovou hmotností v konfiguracích in vivo s možnou nižší afinitou.
Sada pro imunoprecipitaci jaderných proteinů vážících RNA RIP™ (s křížovým propojením) společnostiEZ-Magna	17-10521	.Stejný design jako 17-10520 s přidáním kontrolních protilátek a primerů
Sada pro imunoprecipitaci jaderného RIP™ (nativního) proteinu vážícího jadernou RNA	17-10522	1) Obnovení různých RNA spojených s chromatinem, jako jsou dlouhé nekódující RNA, enhancerové RNA a miRNA, z milionů buněk nebo jen ze 100 000 buněk 2) mnohem nižší pozadí a vysoký poměr signál/šum 3) Očekává se, že nativní RIP obnoví vysoce afinitní, přímější interakce mezi proteiny kódovanými vazebnými motivy RNA a kandidátními RNA.
Sada pro imunoprecipitaci jaderných proteinů vážících RNA RIP™ (nativní) společnostiEZ-Magna	17-10523	Stejný design jako 17-10522 s přidáním kontrolních protilátek a primerů

Sady pro izolaci chromatinu purifikací RNA (ChIRP) a různé sady sond pro lncRNA

Název produktu	Číslo produktu.	Highlights
Magna ChIRP RNA Interactome Kit -Isolation and characterization of non-coding RNA:chromatin complexes	17-10494	Základní souprava ChIRP k obnově komplexů obsahujících nekódující RNA s využitím lncRNA a dalších typů RNA asociovaných s chromatinem jako cílů
SoupravaEZ- Magna ChIRP RNA Interactome Kit -Isolation and characterization of non-coding RNA:chromatinových komplexů	17-10495	Stejný design jako 17-10520 s přidáním biotinylované sady sond pro pozitivní kontrolu lncRNA TERC a sad primerů pro detekci qPCR a RT-qPCR
Sada sond pro negativní kontrolu Magna ChIRP™	03-307	Protože se gen LacZ v savčích buňkách normálně nevyskytuje, je tato sada primerů ideální pro použití jako negativní kontrola při provádění experimentů ChIRP se savčími buňkami pomocí základních souprav Magna ChIRP (č. výrobku 3), např. 17-10494 a 17-10495)
Sada sond Magna ChIRP™ NEAT1 lncRNA	03-308	obsahující 33 předem navržených 20-merových oligonukleotidů DNA poskládaných podél a komplementárních k sekvenci lidské lncRNA NEAT1, připravených k použití v metodě ChIRP se základními soupravami Magna ChIRP (produkt č. 17-10494 a 17-10495).
Sada sond Magna ChIRP™ TERC lncRNA	03-309	obsahující 19 předem navržených 20-merových oligonukleotidů DNA poskládaných podél a komplementárních k sekvenci lidské lncRNA TERC, připravených k použití v metodě ChIRP se základními soupravami Magna ChIRP (produkt č. 17-10494 a 17-10495).
Sada sond pro analýzu myší lncRNA XIST pro metodu Magna ChIRP	03-311M	Myší lncRNA XIST pro metodu Magna ChIRP.obsahující 43 předem navržených 20-merových oligonukleotidů DNA poskládaných podél a komplementárních k sekvenci lncRNA Mouse XIST, připravených k použití v metodě ChIRP se základními soupravami Magna ChIRP (produkt č. 17-10494 a 17-10495).
Sada sond pro Magna ChIRP pro lidskou lncRNA HOTAIR	03-312M	obsahující 48 předem navržených 20-merových oligonukleotidů DNA poskládaných podél a komplementárních k sekvenci lidské lncRNA HOTAIR, připravených k použití v metodě ChIRP se základními soupravami Magna ChIRP (produkt č. 17-10494 a 17-10495).
Sonda Magna ChIRP U1snRNA	03-313M	obsahující 20-merový oligonukleotid DNA dlaždicovitě uspořádaný podél a komplementární k sekvenci lidské malé jaderné 1 U1, připravený k použití v metodě ChIRP se základními soupravami Magna ChIRP (produkt č. 17-10494 a 17-10495).
Sonda Magna ChIRP U2snRNA	03-314	obsahující 20-merový oligonukleotid DNA dlaždicovitě uspořádaný podél a komplementární k sekvenci lidské malé jaderné 1 U2, připravený k použití v metodě ChIRP se základními soupravami Magna ChIRP (výrobky č. 17 a 17), které se používají k analýze U2. 17-10494 a 17-10495).

meRIP

Název produktu	Číslo produktu.	Highlights
Magna MeRIP™ m6A Kit- Transcriptome-wide Profiling of N6-Methyladenosine	17-10499	1) Kompletní kolekce MeRIP validovaných činidel pro zefektivnění metody MeRIP 2) Vysoký poměr signálu k šumu pomocí vysoce afinitní monoklonální protilátky m6A a magnetických kuliček A/G 3) Validace kmenových buněk 4) 6 citací včetně článků v časopisech Nature a Cell.