Generování protilátek: Monoklonální vs. polyklonální protilátky

Protilátky jsou obvykle produkovány B-buňkami, které jsou součástí imunitního systému, v reakci na vniknutí cizorodých látek, například infekčních agens, do těla zvířete. Protilátky se vážou na antigeny, které způsobily jejich vznik, a označují je ke zničení, čímž pomáhají v boji proti infekci. Tuto přirozenou schopnost zvířecího těla lze využít k tvorbě protilátek, které se vážou na specifické molekuly.

Target-specifické protilátky lze použít k izolaci a identifikaci molekul, které jsou předmětem zájmu. Protilátky se staly jedním z nejdůležitějších nástrojů ve výzkumu v oblasti věd o živé přírodě, protože umožňují detekovat, kvantifikovat a určovat změny v proteinech a dalších molekulách s ohledem na čas a další poruchy. 

Přečtěte si, jak se liší monoklonální a polyklonální protilátky, včetně rozdílů ve způsobu jejich tvorby.

• Monoklonální vs. polyklonální protilátky
  
• Klonovací čísla
• Formáty protilátek
• Biologické účinky protilátek
• Související produkty

Monoklonální vs. polyklonální protilátky

Mezi monoklonálními vs. polyklonálními protilátkami existuje řada rozdílů, například ve způsobu jejich tvorby. Mnoho protilátek používaných v imunochemických technikách se získává opakovanou imunizací vhodného zvířete, např. králíka, kozy, osla nebo ovce, vhodným antigenem. Sérum se odebírá na vrcholu produkce protilátek. Touto metodou lze získat specifické koncentrace IgG přibližně 1 až 10 mg/ml séra. Slabě antigenní molekuly mohou vyžadovat přidání adjuvantu, který umožňuje pomalé uvolňování antigenu, takže je snadněji zachytitelný makrofágy. Menší molekuly, jako jsou léky, musí být spojeny s více antigenními strukturami (tj. nosnými proteiny), aby stimulovaly imunitní odpověď.

Jednou z charakteristik velkých antigenních molekul je, že u imunizovaného zvířete vyvolávají aktivaci mnoha klonů B-buněk produkujících protilátky. Tato polyklonální směs výsledných protilátek pak může rozpoznávat různé epitopy na antigenu, což může být užitečná vlastnost při některých experimentálních postupech. Protože tyto polyklonální směsi protilátek reagují s více epitopy na povrchu antigenu, jsou tolerantnější k drobným změnám antigenu, např. polymorfismu, heterogenitě glykosylace nebo mírné denaturaci, než monoklonální (homogenní) protilátky. V závislosti na antigenu, který se používá k vytvoření protilátky, lze polyklonální protilátky použít k identifikaci proteinů s vysokou homologií s proteinem imunogenu nebo ke screeningu cílového proteinu ve vzorcích tkání jiných druhů, než je druh imunogenu. Stejně tak je při práci s polyklonálními protilátkami obzvláště důležité dozvědět se co nejvíce o imunogenu, který byl použit pro výrobu polyklonální protilátky, a o možnosti nežádoucí zkřížené reaktivity v analyzovaném vzorku. Peptidové imunogeny se často používají k výrobě polyklonálních protilátek, které jsou zaměřeny na jedinečné epitopy, zejména u rodin proteinů s vysokou homologií.

Obrázek 1. Generování monoklonálních a polyklonálních protilátek Schéma znázorňující výrobu monoklonálních a polyklonálních protilátek. Výchozím bodem je velký antigenní imunogen, který poskytuje polyklonální protilátky s více epitopy. Šipky jdou dvěma cestami, jedna vede k malému peptidovému imunogenu s menším počtem omezených epitopových polyklonálních protilátek, zatímco druhá vede k bodu, který izoluje a spojuje B buňky s hybridomovou linií a screeningem. Další šipka vede od malého peptidového imunogenu k hybridomu. Odtud vede šipka k dalšímu bodu představujícímu monoklonální protilátku s jedním epitopem. Stranou je buňka s protilátkou, která představuje, že každá B buňka produkuje protilátky pouze proti jednomu epitopu.

Homogenní populaci protilátek (tj. monoklonálních protilátek) lze získat fúzí B lymfocytů s nesmrtelnými buněčnými kulturami za vzniku hybridomů. Hybridomy produkují mnoho kopií přesně stejné protilátky. Tento působivý jev byl zásadní pro vývoj protilátek pro diagnostické aplikace, protože monoklonální protilátky reagují s jedním epitopem na antigenu. Jsou však náchylnější ke ztrátě epitopu chemickou úpravou antigenu než polyklonální protilátky. To lze kompenzovat spojením dvou nebo více monoklonálních protilátek proti stejnému antigenu.

Vlastnosti polyklonálních protilátek

• Polyklonální protilátky často rozpoznávají více epitopů, takže jsou tolerantnější k malým změnám v povaze antigenu. Polyklonální protilátky jsou často preferovanou volbou pro detekci denaturovaných proteinů.
• Polyklonální protilátky mohou být vytvořeny u různých druhů, včetně králíka, kozy, ovce, osla,
  kuřete a dalších, což dává uživatelům mnoho možností při navrhování experimentů.
• Polyklonální protilátky se někdy používají, pokud není známa povaha antigenu u netestovaného druhu.
• Polyklonální protilátky se zaměřují na více epitopů, a tak obecně poskytují robustnější detekci.

Vlastnosti monoklonálních protilátek

• Díky své specifičnosti jsou monoklonální protilátky vynikající jako primární protilátka v testu nebo pro detekci antigenů ve tkáni a často vedou k výrazně nižšímu signálu pozadí než polyklonální protilátky.
• V porovnání s polyklonálními protilátkami je homogenita monoklonálních protilátek velmi vysoká.
• Pokud jsou experimentální podmínky konstantní, výsledky monoklonálních protilátek budou mezi jednotlivými experimenty vysoce reprodukovatelné.
• Specifičnost monoklonálních protilátek je činí mimořádně účinnými pro vazbu antigenu v rámci směsi příbuzných molekul, například v případě afinitní purifikace.

Výhody a nevýhody monoklonálních vs. polyklonálních protilátek

	Výhody	Nevýhody
Polyklonální protilátky	Uhynulé zvíře může ukončit zdroj protilátek. Různá krvácení mohou poskytnout různé výsledky. Imunizace nového zvířete stejným antigenem může vést k různým epitopům a mohou vzniknout různé klony. Sdílené epitopy na různých proteinech mohou vést ke značení jiných proteinů, než je protein antigenu. Možná je větší variabilita mezi jednotlivými šaržemi. Může dojít ke vzniku nespecifických protilátek, které mohou zvýšit signál pozadí.	Relativně snadné generování a nákladově efektivnější. Více epitopů na stejném proteinu může generovat mnoho protilátek. Proto poskytují robustnější signály. Polyklonální protilátky mohou generovat lepší signály u proteinů exprimovaných v nízkých hladinách. Jsou kompatibilní s širší škálou aplikací. Polyklonální protilátky poskytují větší flexibilitu při rozpoznávání antigenu. Mohou například vázat antigen navzdory polymorfismu, heterogenitě glykosylace atd. Proto mohou identifikovat proteiny s vysokou homologií nebo z různých druhů. Vhodnější pro detekci denaturovaných proteinů.
Monoklonální protilátky	Různé klony protilátek mohou být generovány na různé epitopy na jednom antigenu. Hybridní buňky mohou sloužit jako nekonečný zdroj stejné protilátky. Vysoká specifičnost monoklonálních protilátek minimalizuje pozadí a eliminuje zkříženou reaktivitu. Její homogenita je velmi vysoká a poskytují konzistentní, reprodukovatelné výsledky. Vážou se pouze na jeden antigen ve směsi příbuzných proteinů. Variabilita mezi jednotlivými šaržemi je velmi minimální.	Výroba monoklonálních protilátek je pracnější. Vyžaduje více práce, zejména v procesu klonování a selekce. Mohou mít omezené možnosti použití. Velká většina monoklonálních protilátek se vyrábí na myších, protože je k dispozici robustní myelomová buněčná linie. Vysoká specifita monoklonálních protilátek omezuje jejich použití u více druhů. Monoklonální protilátky jsou náchylnější ke ztrátě epitopu chemickou úpravou antigenu.

Čísla klonů

Každé číslo klonu představuje konkrétní buněčnou linii, která byla použita k výrobě protilátky. Protože protilátky jsou produkovány více než jedním hostitelem, každá klonovaná buněčná linie dostává jedinečné číslo klonu. Každý klon hybridomových buněk produkuje pouze jeden jediný čistý typ protilátky.

• Zvíře, kterému je aplikován antigen, vytvoří více protilátek proti mnoha epitopům. Protože protilátky jsou produkovány buňkami B, může jeden klon buněk B produkovat protilátky pouze proti jednomu epitopu.
• Monoklonální protilátky jsou odvozeny z jednoho klonu buněk a mohou být generovány ve větším množství.
• Polyklonální protilátky obsahují více klonů protilátek produkovaných proti různým epitopům na antigenu. Například pokud jsou na antigenu čtyři epitopy, pak se vytvoří čtyři různé klony protilátek.
• Různé klony protilátek mohou mít různé vlastnosti a mohou mít i různé izotypy. Mohou také fungovat v různých aplikacích. Proto je nejlepší vybrat klon protilátky, který bude optimálně fungovat ve vámi zvolené aplikaci.
• Je důležité si uvědomit, že číslo klonu není synonymem čísla šarže, které často označuje datum výroby.

Formáty protilátek

Jak název napovídá, formát protilátky se vztahuje k prezentaci nebo stavu purifikace protilátky. Různé formáty jsou popsány níže:

Polyklonální protilátky

Polyklonální protilátky jsou často dostupné v relativně nepřečištěných formátech a označují se jako "antisérum" nebo jednoduše jako "sérum". Antisérum označuje krev imunizovaného hostitele, z níž byly odstraněny srážlivé proteiny a krevní krvinky. Jak již název napovídá, antisérum stále obsahuje protilátky/imunoglobuliny všech tříd a také další sérové bílkoviny. Kromě protilátek, které rozpoznávají cílový antigen, obsahuje antisérum také protilátky proti různým jiným antigenům, které mohou někdy v imunologických testech reagovat nespecificky. Z tohoto důvodu se surové antisérum často podrobuje purifikačním krokům, aby se eliminovaly sérové proteiny a obohatila frakce imunoglobulinu, která specificky reaguje s cílovým antigenem.

Antisérum se běžně purifikuje jednou ze dvou metod:

Purifikace proteinem A/G nebo afinitní chromatografií k antigenu.

Purifikace proteinem A/G využívá vysoké afinity Staphylococcus aureus proteinu A nebo Streptococcus proteinu G k Fc doméně imunoglobulinu. Zatímco purifikace proteinem A/G eliminuje většinu sérových proteinů ze surového antiséra, neeliminuje nespecifickou imunoglobulinovou frakci. Výsledkem je, že antisérum purifikované proteinem A/G může stále vykazovat nežádoucí zkříženou reaktivitu.

Afinitní purifikace antiséra využívá afinitu specifické imunoglobulinové frakce k imunizačnímu antigenu, proti kterému byla vytvořena. Tuto metodu lze použít k odstranění nežádoucích protilátek z přípravku. Preparát protilátek prochází přes matrici kolon obsahující antigeny, proti nimž jsou nežádoucí protilátky namířeny. Nežádoucí protilátky zůstávají navázány na koloně a výtok obsahuje požadované, afinitně přečištěné protilátky. Alternativně lze použít matrici kolony spojenou s požadovaným antigenem. V tomto případě protilátka namířená proti spojenému antigenu zůstává navázána na koloně a může být poté eluována pomocí roztoku, který narušuje vazbu antigen-protilátka. Na rozdíl od purifikace proteinem A/G vede afinitní purifikace antigenu k odstranění většiny nespecifické imunoglobulinové frakce a zároveň k obohacení frakce imunoglobulinu, který specificky reaguje s cílovým antigenem. Výsledný afinitně purifikovaný imunoglobulin bude obsahovat především imunoglobulin požadované specifity.

Typicky vykazují afinitně purifikované protilátky nižší pozadí než neabsorbované protilátky a tento purifikační proces je důležitý zejména pro obtížné nebo na stavu závislé epitopy. Při vývoji polyklonálních protilátek, které rozpoznávají cíle s posttranslačními modifikacemi, může použití afinitních kolonek specifických pro modifikaci antigenu během procesu purifikace významně zlepšit specifitu protilátky pro stavově závislý cíl. Odstranění nemodifikovaného cílového proteinu ze séra před afinitní purifikací (s použitím imobilizovaného modifikovaného cílového proteinu) zvyšuje specifitu pro modifikovaný cíl. Poté lze provést testování specifičnosti, aby se potvrdilo, že protilátka rozpoznává pouze posttranslačně modifikovanou formu proteinu.

Monoklonální protilátky

Monoklonální protilátky mohou být pěstovány v buněčných kulturách a odebírány jako supernatanty hybridomů nebo pěstovány u myší či potkanů a odebírány jako relativně nepřečištěná tekutina ascitu. Ty mohou být purifikovány pomocí protein A/G nebo specifické antigenní afinitní chromatografie jako u polyklonálních protilátek.

Přípravky nepurifikovaných protilátek se značně liší specifickou koncentrací protilátek. Pokud není známa specifická koncentrace protilátek daného preparátu nepurifikovaných protilátek, lze jako vodítko pro odhad použít následující "typická rozmezí":

• Polyklonální antisérum:
• Specifické koncentrace protilátek se obvykle pohybují v rozmezí 1-3 mg/ml.
• Hybridomový supernatant: Specifické koncentrace protilátek se obvykle pohybují v rozmezí 0,1-10,0 mg/ml.
• Acitová tekutina (nepurifikovaná): Specifické koncentrace protilátek se obvykle pohybují v rozmezí 2-10 mg/ml.

O dalším formátu protilátek, rekombinantních protilátkách, které jsou vysoce reprodukovatelné, se dozvíte v našem technickém článku na ZooMAb^® rekombinantní monoklonální protilátky.

Biologické účinky protilátek

Protilátky se široce používají k ochraně před infekčními agens. Většina vakcín (mikrobiálních antigenů) vyvolává tvorbu protilátek, které blokují infekci nebo brání mikrobiální invazi do krevního oběhu. Aby toho bylo dosaženo, musí být protilátky funkční v tom smyslu, že jsou schopny neutralizace nebo opsonofagocytózy.

Citolýza komplexu membránového útoku (MAC) MAC se tvoří na povrchu patogenní bakteriální buňky v důsledku aktivace systému komplementu (alternativní i klasické cesty). MAC vytváří transmembránové kanály v bakteriálních stěnách, narušuje jejich fosfolipidovou dvojvrstvu a vede k lýze a smrti buňky.

Neutralizace virů

Protilátky mohou narušit vazbu virionů na receptory a zablokovat jejich příjem do buněk. Mnoho obalených virů je lyzováno, když protilátky proti virům a komplementový systém naruší membrány. Některé protilátky mohou také agregovat virové částice. Po každé virové infekci se také vytvářejí neutralizační protilátky. Tyto protilátky se sice specificky vážou na virové částice, ale ne neutralizují je. Naopak mohou zvýšit infekčnost, protože komplex viru a protilátky vstupuje do buňky endocytózou. To může vést k replikaci viru. Typ produkované protilátky může ovlivnit výsledek virové infekce. Například poliovirus může v krvi vyvolat reakce IgM a IgG, ale pro zablokování infekce je zásadní slizniční IgA. IgA neutralizuje poliovirus ve střevě, v místě primární infekce. Proto je živá oslabená vakcína proti polioviru Sabin účinnější, protože vyvolává silnou slizniční IgA odpověď.

Imobilizace

Protilátka může být namířena proti řasinkám nebo bičíkům pohyblivých bakterií nebo prvoků, což vede k zastavení jejich pohyblivosti a blokuje jejich schopnost pohybovat se a šířit infekci.

Cytolýza

Některé protilátky mohou způsobit narušení mikrobiální membrány, které má za následek smrt bakteriálních buněk. To vyžaduje účast komplementového systému.

Opsonizace

Při tomto procesu je patogenní organismus cíleně tráven fagocyty. Protilátka se naváže na receptor na buněčné membráně bakterie a přiláká fagocyty na místo. F(ab) část protilátky se váže na antigen, zatímco Fc část protilátky se váže na Fc receptor na fagocytu a usnadňuje fagocytózu. Tento proces je dále posílen systémem komplementu.

Neutralizace exotoxinů

Proti mikrobiálním toxinům lze vytvořit antitoxinové protilátky. Oblast F(ab) protilátky vyrobené proti epitopu vazebného místa exotoxinu může blokovat vazbu exotoxinu na exotoxinový receptor na membráně hostitelské buňky. Tím se zablokuje vstup toxinu do buňky.

Zabránění adhezi bakterií na hostitelské buňky

Vrozená obranyschopnost organismu může fyzicky odstranit bakterie neustálým vylučováním povrchových epiteliálních buněk z kůže a sliznic. Bakterie se však mohou tomuto postupu bránit tvorbou pili, adhezivních proteinů buněčné stěny a kapslí produkujících biofilm. Oblast F(ab) protilátky se může vázat na adhezivní špičku pili, adheziny buněčné stěny nebo kapsulární molekuly a blokuje adhezi bakterií k buňkám hostitele.

Aglutinace mikroorganismů

Místa F(ab) protilátek IgM a IgA mohou spojovat mikroorganismy a způsobovat jejich aglutinaci. Aglutinované mikroorganismy mohou být účinněji fagocytovány.

Produkty

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch