Přejít k obsahu
Merck
DomůExprese a umlčování genůTest imunoprecipitace chromatinu (ChIP)

Test imunoprecipitace chromatinu (ChIP)

Co je to ChIP analýza?

Chromatinová imunoprecipitační analýza (ChIP) se používá k hodnocení interakcí mezi transkripčními faktory a DNA a má zásadní význam pro pokrok ve studiích regulace genové exprese a epigenetických modifikací. ChIP může detekovat a relativně kvantifikovat specifické interakce protein-DNA a protein-protein in vivo na jednom lokusu nebo více lokusech. ChIP zahrnuje chemické zesíťování proteinů se sekvencemi DNA, po kterém následuje imunoprecipitace zesíťovaných komplexů (obrázek 1) a analýza výsledné DNA pomocí koncové nebo kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR) (obrázky 2-4), mikročipů (ChIP-chip) nebo sekvenování nové generace (ChIP-seq) (obrázky 5 a 6).

Pracovní postup testu imunoprecipitace chromatinu (ChIP)

Pracovní postup ChIP

Obrázek 1.Pracovní postup ChIP

Song et al., 2015

Protein a související chromatin v živých buňkách nebo tkáních jsou zesíťovány pomocí formaldehydu. Zesíťované komplexy DNA-protein (chromatin-protein) se poté stříhají na fragmenty DNA o velikosti ∼500 bp buď enzymatickým štěpením, nebo fyzickým stříháním pomocí sonikace. Komplexy DNA-protein se poté imunoprecipitují vhodnou proteinově specifickou protilátkou. Po zrušení příčných vazeb se eluují asociované fragmenty DNA, po čemž následuje imunoprecipitace zesíťovaných komplexů a analýza výsledné DNA pomocí koncové nebo kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR), mikročipů (ChIP-chip) nebo sekvenování nové generace (ChIP-seq).

ChIP testy lze použít pro následující studie:

  • Sekvence DNA obsazené více specifickými proteinovými cíli
  • Vazbová místa a distribuce určitého proteinu, jako jsou transkripční faktory, transkripční kofaktory, faktory replikace DNA a opravné proteiny DNA, v celém genomu za určitých buněčných podmínek
  • Transkripce genů a polymerázová aktivita
  • Složité interakce DNA a proteinů, které jsou základem fenotypů onemocnění
  • Modifikace proteinů, jako jsou histony, které mohou ovlivňovat strukturu chromatinu a expresi genů
  • Architektura nukleozomů a regulace údržby chromozomů

ChIP obohacení sekvencí DNA z buněk

ChIP se vzorky buněčných linií

Obrázek 2.ChIP se vzorky buněčných linií.

Horní panel: Úspěšné obohacení ChIP sekvencí DNA spojených s heterochromatinovým proteinem 1d gamma (HP1gamma), důležitým markerem genové represe. Data získaná pomocí sady protilátek/primerů ChIPAb+™ Hp1gamma, myšího IgG (nespecifická kontrola) a soupravy Magna ChIP™ G (č. produktu 17-10085).

Dolní panel: Vysoce výkonná (96jamková destička) analýza ChIP více proteinových cílů pro dotazování genových lokusů za různých podmínek pomocí panelů protilátek a sady Magna ChIP™ HT96 (č. výrobku 17-10077).

Efektivní testy ChIP se vzorky tkání

ChIP se vzorky tkání

Obrázek 3.ChIP se vzorky tkání.

Horní panel: Kryosekce tkáně a izolace vzorku tkáně specifické pro danou oblast pomocí dodaného mikrodisekčního razníku o průměru 1 mm. Příklad izolace tkáně specifické pro danou oblast je zobrazen na obrázku. Koronální řez myším mozkem o velikosti 300 µm s regionálně specifickou mikrodisekcí hipokampu (A) a mozkové kůry (B). Izolovaná tkáň byla umístěna nad vypreparovanou oblastí (a: hipokampus, b: mozková kůra). Vyčištěná tkáň se následně rozptýlí tkáňovým stabilizačním roztokem a poté se ošetří formaldehydem. Formaldehyd zesíťuje proteiny s DNA, aby se zajistila ko-precipitace.

Dolní panel: Chromatin z různých buněčných linií byl podroben imunoprecipitaci s uvedenými protilátkami pomocí soupravy Magna ChIP™ G Tissue (č. produktu 17-20000). Pro relativní srovnání byl použit buď králičí purifikovaný IgG (č. výrobku PP64B), nebo myší purifikovaný IgG (č. výrobku 12- 371B), v závislosti na protilátce ChIP. Kvantitativní údaje PCR jsou prezentovány jako násobné relativní obohacení vůči IgG z nezávislých experimentů nebo jako % vstupu. Pro biologickou negativní kontrolu byla qPCR vyhodnocena s primery před genem Dhfr (UpSt (-)). Byly použity následující protilátky a primery: Anti-RNA Polymerase II klon CTD4H8 (č. produktu 05-623B): 1 µg myší monoklonální afinitně přečištěné protilátky imunoprecipitované s chromatinem různých myších tkání a qPCR testované s primery specifickými pro myší promotor GAPDH a Anti-SP1 (č. produktu 07-645): 1 µg myší monoklonální afinitně přečištěné protilátky imunoprecipitované z chromatinu různých myších tkání a testované qPCR s primery specifickými pro myší promotor Dhfr.

Vyšší obohacení násobků při použití malého množství chromatinu nebo kratší doba postupu analýzy ChIP

Naše soupravy umožňují vyšší násobné obohacení při použití malého množství chromatinu nebo kratšího postupu než soupravy jiných dodavatelů.

Obrázek 4.Naše soupravy umožňují vyšší násobné obohacení při použití malého množství chromatinu nebo kratšího postupu než soupravy jiných dodavatelů.

Horní panel: 10 000 buněčných ekvivalentů sonikovaného chromatinu připraveného z HeLa buněk bylo imunoprecipitováno pomocí 1 µg purifikovaného IgG (králičí IgG, produkt č. 1). 12-370) nebo specifických protilátek (H3K4Me3, č. produktu 17-614; Phospho-CREB, č. produktu 17-10131). Při každém testu byla použita buď činidla a protokol dodávané se sadou Magna ChIP™ HiSens Kit (č. výrobku 17-10460), nebo činidla ze sady ChIP s nízkým vstupním množstvím od dodavatele A nebo dodavatele D. Imunoprecipitace fragmentů DNA asociovaných s protilátkami byla ověřena pomocí qPCR s použitím pozitivních kontrolních primerů (primery promotoru GAPDH pro H3K4me3 a primery promotoru c-Fos pro pCREB) a negativních kontrolních primerů (primery promotoru lidského ß-globinu). Výsledky odrážejí analýzu 2 µl z 50 µl celkové DNA na reakci qPCR.

Dolní panel: Kompletní reakce ChIP za 6 hodin ve formátu flexibilních strip jamek pro soupravu Imprint® Chromatin Immunoprecipitation Kit (produkt č. ChIP1) Srovnání času potřebného k dokončení protokolu od fixace po purifikaci pomocí různých souprav pro imunoprecipitaci chromatinu. Každý experiment ChIP byl proveden s použitím protokolu doporučeného jednotlivými výrobci a byly porovnány celkové potřebné časy. HeLa buňky byly spočítány, fixovány a imunoprecipitovány podle bulletinu Imprint CHP1 s volitelnou metodou High Sensitivity. Testy ChIP byly provedeny s použitím Anti-H3K9ac (H9286) a protilátek proti lidské RNA polymeráze II a nespecifického myšího IgG dodaných v kitu. Pro vyhodnocení obohacení ChIP byla provedena SYBR qPCR zaměřená na oblast promotoru GAPDH (vysoce exprimovaný housekeepingový gen). Procentuální vstup popisuje množství DNA se selekcí protilátek a bez ní. U těchto protilátek se zjevné obohacení zvýšilo s menším počtem buněk na reakci v důsledku snížení nespecifického stahování

.

ChIP DNA analyzované sekvenováním nové generace (ChIP-seq)

Analýza ChIP-Seq
Analýza ChIP-Seq
Analýza ChIP-Seq

Obrázek 5.Analýza ChIP-Seq

Imunoprecipitace chromatinu byla provedena pomocí soupravy Magna ChIP™ HiSens (č. produktu  17-10460), 2 µl, 2 µg nebo 5 µg protilátky anti-H3K4me2 (č. produktu  17-10460). 04-790, 05-1338 nebo ABE250), nebo 1 nebo 3 µl nebo 4 µg protilátky anti-H3K4me3 (produkt č. 05-745R, 07-473 nebo 05-1339), nebo 2 µg protilátky anti-H3K36me3 (produkt č. 4743)/a> (produkt č. 4743)/a> nebo 05-1339). ABE435), 20 µl magnetických kuliček Protein A/G a 1e6 nebo 4e6 nebo 5e6 zesíťovaného chromatinu HeLa buněk s následným přečištěním DNA. Knihovny byly připraveny ze vstupních vzorků DNA a vzorků ChIP pomocí standardních protokolů s adaptéry Illumina s čárovým kódem a analyzovány na přístroji Illumina HiSeq™. Převaha dvanácti milionů čtení ze souborů FastQ byla mapována pomocí nástroje Bowtie (http://bowtiebio.sourceforge.net/manual.shtml) po odstranění značek TagDust (http://genome.gsc.riken.jp/osc/english/dataresource/). Píky byly identifikovány pomocí MACS (http://luelab.dfci.harvard.edu/MACS/), přičemž píky a čtení byly vizualizovány jako vlastní stopa v UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu) ze souborů BigWig a BED. Nejvyšších 25 % píků identifikovaných v datech vykazovalo 90-99% překryv s píky identifikovanými ve stopách ENCODE H3K4me2 nebo H3K4me3 nebo H3K36me3 BROAD Histone pro HeLa S3. Zobrazena jsou data v oblasti transkripčně aktivního housekeepingového genu TUBA1A (tubulin, alfa 1A), HOXB, ACTB nebo GAPDH.

ChIP test a sekvenování nové generace s využitím malého množství DNA

Efektivní ChIP a spolehlivá konstrukce knihoven pro sekvenování nové generace z omezeného množství DNA

Obrázek 6.Efektivní ChIP a spolehlivá konstrukce knihoven pro sekvenování nové generace z omezeného množství DNA.

Knihovny pro sekvenování nové generace byly vytvořeny z DNA Sp1 ChIP s použitím 10 ng (horní panel) nebo 1 ng kvantifikované imunoprecipitované DNA (střední panel). Referenční knihovna byla vytvořena pomocí 10 ng purifikované DNA ze vstupního chromatinu. Vzorky byly připraveny pomocí sady Magna ChIP-Seq Kit (č. produktu  17-1010) a sady protilátek/primerů ChIPab+ Sp1 (č. produktu  17-601). Výsledné knihovny byly sekvenovány na přístroji Illumina Genome Analyzer a poté zarovnány a namapovány na lidský referenční genom hg18. Výše je zobrazena výsledná analýza píků (získaná pomocí QuEST) lokusu Sp1 z jistě zmapovaných čtení procházených pomocí softwaru DNAnexus™. Jsou porovnány replikované sekvenační běhy z 10 ng a 1 ng knihoven, které ukazují překrývající se identifikaci píků v promotoru genu Sp1. Trojúhelníky odrážejí vysoce pravděpodobné vazebné události Sp1 spojené především s místy startu transkripce v tomto genomovém intervalu.

Průvodce experimenty sChIP, nejčastější dotazy, tipy pro řešení problémů a doplňkové protokoly

ChIP může být náročný i pro ty nejzkušenější výzkumníky. Jedná se o vícekrokovou techniku (obrázek 1), která vyžaduje vysoce kvalitní chromatin, robustní protilátky, optimalizovaná činidla a protokoly, aby bylo možné získat spolehlivé a reprodukovatelné výsledky. Těch se obvykle dosahuje buď použitím komerčně připravených produktů a protokolů, nebo provedením několika validačních experimentů. Bez ohledu na to, které strategii dáváte přednost, níže jsou uvedeny komplexní průvodce experimenty ChIP, které vám pomohou vyřešit některé problémy, s nimiž se při ChIP běžně setkáváte, od přípravy vzorků až po následnou analýzu DNA.

Který ChIP kit je pro vás ten pravý?

Standardní ChIP kity

Speciální soupravy ChIP

Příslušenství k čipům ChIP

Související články
Chcete-li pokračovat, musíte se přihlásit.

Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.

Nemáte účet?