Úvod do protilátek: Úvod do problematiky antigenů, epitopů a protilátek

V první polovině 20. století se díky řadě vědeckých objevů podařilo zjistit, že základem specifické imunitní odpovědi je imunita zprostředkovaná protilátkami. Od jejich prvního použití jako výzkumných nástrojů pro imunoznačení na počátku 70. let 20. století se technologie protilátek značně zdokonalily a protilátky se staly rozhodujícími nástroji pro většinu oblastí výzkumu v oblasti přírodních věd. Základním principem každé imunochemické techniky je, že specifická protilátka se spojí se svým specifickým antigenem a vytvoří exkluzivní komplex protilátka-antigen. Na následujících stránkách se budeme zabývat povahou této vazby a využitím této robustní a specifické vazby jako molekulární značky pro výzkum.

• Antigeny
• Epitopy
• Protilátky
• Podtřídy protilátek

Antigeny

Termín antigen je odvozen od pojmu tvorba protilátek a označuje jakoukoli látku, která je schopna vyvolat imunitní reakci (např. tvorbu specifických molekul protilátek). Podle definice je antigen (Ag) schopen se spojit se specifickými protilátkami, které se v jeho přítomnosti vytvoří.

Všeobecně jsou antigeny cizorodé bílkoviny nebo jejich fragmenty, které se do těla hostitele dostanou prostřednictvím infekce. V některých případech však mohou jako antigeny působit i tělu vlastní bílkoviny a vyvolat autoimunitní reakci. Bakterie a viry obsahují antigeny buď na svém povrchu, nebo uvnitř. Tyto antigeny lze izolovat a použít k vývoji vakcín.

Antigeny mají obvykle vysokou molekulovou hmotnost a běžně se jedná o proteiny nebo polysacharidy. Jako antigeny mohou fungovat také polypeptidy, lipidy, nukleové kyseliny a mnoho dalších materiálů. Imunitní reakce mohou být vyvolány také proti menším látkám, tzv. haptenům, pokud jsou chemicky spojeny s větším nosným proteinem, jako je hovězí sérový albumin, hemocyanin z klíčové dírky (KLH) nebo jiné syntetické matrice. Jako hapteny mohou fungovat různé molekuly, například léčiva, jednoduché cukry, aminokyseliny, malé peptidy, fosfolipidy nebo triglyceridy. Za dostatečně dlouhou dobu tak imunitní systém identifikuje téměř jakoukoli cizorodou látku a vyvolá produkci specifických protilátek. Tato specifická imunitní odpověď je však velmi variabilní a závisí z velké části na velikosti, struktuře a složení antigenů. Za nejvhodnější antigeny jsou považovány bílkoviny nebo glykoproteiny díky své schopnosti vyvolat silnou imunitní odpověď, jinými slovy jsou silně imunogenní. Antigeny jsou v těle hostitele rozpoznávány dvěma odlišnými procesy: (1) pomocí B buněk a jejich povrchových protilátek (sIgM) a (2) pomocí T buněčného receptoru na T buňkách. Ačkoli B i T buňky reagují na stejný antigen, reagují na různé části téže molekuly. Protilátky na povrchu B buněk mohou rozpoznávat terciární strukturu proteinů. Naproti tomu buňky T vyžadují antigeny, které byly pozřeny a rozloženy na rozpoznatelné fragmenty buňkami prezentujícími antigen. Běžně používané antigen prezentující buňky jsou makrofágy a dendritické buňky. Imunitní odpověď je znázorněna na obrázku 1. Pro podrobnější informace o přirozeném procesu tvorby protilátek je třeba nahlédnout do vhodné učebnice imunologie.

Obrázek 1. Imunitní reakce.

Epitopy

Malé místo na antigenu, na které se může specificky vázat komplementární protilátka, se nazývá epitop nebo antigenní determinant. Obvykle se jedná o jeden až šest monosacharidů nebo pět až osm aminokyselinových zbytků na povrchu antigenu. Protože molekuly antigenu existují v prostoru, může být epitop rozpoznávaný protilátkou závislý na přítomnosti specifické trojrozměrné antigenní konformace (např. jedinečné místo vytvořené interakcí dvou nativních proteinových smyček nebo podjednotek). To je známé jako konformační epitop. Epitop může také odpovídat jednoduché lineární sekvenci aminokyselin a takové epitopy se označují jako lineární epitopy.

Škála možných vazebných míst na cílové molekule (antigenu) je obrovská, přičemž každé potenciální vazebné místo má své vlastní strukturní vlastnosti odvozené od kovalentních vazeb, iontových vazeb, hydrofilních a hydrofobních interakcí. To má skutečně důležité důsledky pro výběr a výkon protilátek. Aby mohlo dojít k účinné interakci mezi cílovým antigenem a protilátkou, musí být epitop snadno dostupný pro vazbu.

Pokud je cílová molekula denaturována, např. fixací, redukcí, změnou pH nebo během přípravy pro gelovou elektroforézu, může být epitop změněn, což může ovlivnit jeho schopnost interagovat s protilátkou. Například některé protilátky jsou neúčinné při Western blottingu (WB), ale jsou vhodné pro imunohistochemické aplikace (IHC), protože při postupu IHC může být ve tkáni zachováno komplexní antigenní místo, zatímco při postupu WB proces přípravy vzorku změní konformaci proteinu natolik, že antigenní místo zničí, a tím vyloučí vazbu protilátky.

U denaturovaného proteinu může být rozpoznán pouze lineární epitop. Proto se v protokolech, kde se používá denaturovaný protein, například při Western blottingu, dává přednost protilátce, která rozpoznává lineární epitop. Někdy se epitop nachází na vnitřní straně složeného proteinu. Epitop je pak pro protilátku nepřístupný v nedenaturačním protokolu, jako je imunoprecipitace. Konformační epitop se podle definice nachází na vnější straně složeného proteinu. Protilátka, která rozpoznává konformační epitop, je vhodná pro mírné, nedenaturované postupy, jako je imunoprecipitace nebo průtoková cytometrie.

Optimálně bude protilátka, která rozpoznává lineární epitop na povrchu normálně složeného proteinu, dobře fungovat v nedenaturovaných i denaturačních protokolech. Epitop tedy může být přítomen v nativním, buněčném prostředí antigenu, nebo může být odhalen pouze při denaturaci. Ve své přirozené formě mohou být antigeny cytoplazmatické (rozpustné), membránově asociované nebo vylučované. Počet, umístění a velikost epitopů závisí na tom, jak velká část antigenu je prezentována během procesu tvorby protilátky.

Znalosti o cílovém proteinu, epitopu rozpoznávaném protilátkou, zachování sekvence a principech techniky jsou cenné při správném výběru protilátky a protokolu. Skutečné mapování epitopů nebo údaje o sekvenci, i když jsou užitečné, však nejsou nutné k tomu, abychom si byli jisti specifičností protilátky.

Obrázek 2. Aminokyseliny tvořící bílkovinu.

Protilátky

Protilátka je definována jako "imunoglobulin schopný specifické kombinace s antigenem, který způsobil jeho tvorbu u vnímavého živočicha." Protilátky se vytvářejí jako odpověď na vniknutí cizorodých molekul do organismu. Protilátka, zkráceně Ab, se běžně označuje jako imunoglobulin nebo Ig. Lidské imunoglobuliny jsou skupinou strukturně a funkčně podobných glykoproteinů (82-96 % bílkovin a 4-18 % sacharidů), které zajišťují humorální imunitu.

Struktura

Protilátky existují jako jedna nebo více kopií jednotky ve tvaru Y, která se skládá ze čtyř polypeptidových řetězců. Každý Y obsahuje dvě identické kopie těžkého řetězce a dvě identické kopie lehkého řetězce, které jsou takto pojmenovány podle své relativní molekulové hmotnosti. Tato jednotka ve tvaru Y se skládá ze dvou variabilních, pro antigen specifických ramen F(ab), která jsou rozhodující pro skutečnou vazbu antigenu, a z konstantního "ocasu" Fc, který váže Fc receptory imunitních buněk a slouží také jako užitečná "rukojeť" pro manipulaci s protilátkou během většiny imunochemických postupů. Počet oblastí F(ab) na protilátce odpovídá její podtřídě (viz níže) a určuje valenci protilátky (volně řečeno počet "ramen", kterými může protilátka vázat svůj antigen).

Obrázek 3. Struktura protilátky.

Tyto tři oblasti mohou být rozštěpeny proteolytickým enzymem papainem na dva fragmenty F(ab) a jeden Fc nebo pepsinem na pouhé dvě části: jeden F(ab')2 a jeden Fc v oblasti závěsu. Fragmentace protilátek IgG je někdy užitečná, protože F(ab) fragmenty nesrážejí antigen a v živých studiích se na ně nevážou imunitní buňky, protože nemají Fc oblast.

Třída/podtřída	Těžký řetěz	Lehký řetězec	MW (kDa)	Struktura	Funkce
IgA1 IgA2	��1 ��2	�� nebo ��	150 až 600	Monomer nebo tetramer	Nejvíce produkovaný Ig; chrání slizniční povrchy; odolný vůči trávení; vylučován v mléce
IgD	��	�� nebo ��	150	Monomer	Funkce nejasná; spolupracuje s IgM při vývoji B-buněk ; většinou vázán na B-buňky
IgE	��	�� nebo ��	190	Monomer	Brání se proti parazitům; způsobuje alergické reakce
��1 ��2 ��2 ��3 ��4	�� nebo ��	150	Monomer	Hlavní Ig v séru; dobrý opsonizátor; mírný komplement fixátor (IgG3); může přecházet přes placentu
IgM	��	�� nebo ��	900	Pentamer	Protilátka první reakce; silný komplement fixátor; dobrý opsonizátor

Třídy podtříd protilátek

Třídy protilátek lze rozdělit do pěti tříd: IgG, IgM, IgA, IgD a IgE podle počtu jednotek Y a typu těžkého řetězce. Těžké řetězce IgG, IgM, IgA, IgD a IgE se označují jako g, µ, a, d a e v tomto pořadí. Lehké řetězce každé protilátky lze klasifikovat jako typ kappa (κ) nebo lambda (λ) (na základě malých  strukturních rozdílů polypeptidů); těžký řetězec však určuje podtřídu každé protilátky.

Podtřídy protilátek se liší počtem disulfidických vazeb a délkou oblasti závěsu. V imunochemických postupech se nejčastěji používají protilátky třídy IgG, protože se jedná o hlavní třídu imunoglobulinů uvolňovaných v séru.

IgA

V krvi jsou IgA přítomny v nízkém množství v monomerní formě. Nejaktivnější jsou na slizničních površích, kde jsou přítomny v dimerní formě a zajišťují primární obranu na slizničních površích. Ve slizničních výstelkách se tvoří více IgA než všechny ostatní typy protilátek dohromady. Její hlavní funkcí je působit jako neutralizační protilátka. Vysoké hladiny IgA jsou přítomny ve slinách, slzách a mateřském mléce. U lidí jsou známy dva podtypy IgA, zatímco u myší je uváděna pouze jedna forma. IgA1 může tvořit až 85 % celkového IgA v séru. Selektivní nedostatek IgA je jedním z nejčastějších imunodeficitních onemocnění, které zvyšuje náchylnost k infekcím. Deficit IgA se běžně vyskytuje u pacientů s autoimunitními chorobami a alergickými poruchami. Poločas rozpadu IgA je přibližně 5 dní.

IgD

Jedná se o monomerní protilátku se dvěma vazebnými místy pro epitop, která se nachází na povrchu většiny B lymfocytů. Její přesná funkce je stále sporná, ale předpokládá se, že působí jako antigenní receptor potřebný pro aktivaci B buněk. Uvádí se také, že IgD se váže na bazofily a žírné buňky a aktivuje je k produkci antimikrobiálních faktorů. Předpokládá se také, že hraje roli při eliminaci B-lymfocytů, které produkují autoreaktivní autoprotilátky. IgD je také produkován v sekreční formě, která se v malém množství nachází v séru a obsahuje dva těžké řetězce třídy δ a dva lehké řetězce. Poločas rozpadu IgD je přibližně 3 dny.

IgE

Tato skupina protilátek působí na slizniční povrchy, krev a tkáně. Vyskytuje se jako monomer složený ze dvou těžkých řetězců (ε řetězec) a dvou lehkých řetězců. Řetězec ε obsahuje 4 konstantní domény podobné Ig. V séru je přítomen v nízkých koncentracích a tvoří pouze asi 0,002 % celkového množství protilátek v séru. Většina IgE je pevně vázána na své receptory na žírných buňkách a bazofilech prostřednictvím Fc oblasti. Hraje klíčovou roli v reakcích přecitlivělosti a jeho produkce je přísně kontrolována cytokiny. Poločas rozpadu IgE je přibližně 2 dny.

IgG

Jedná se o nejpočetnější třídu protilátek v krvi, která tvoří až 80 % všech protilátek v séru. Je přítomna v monomerní formě. Byly popsány čtyři podtřídy IgG v závislosti na jejich množství (IgG1>IgG2>IgG3>IgG4) a produkovaná podtřída závisí na typu přítomného cytokinu.

IgG1 a IgG3 vykazují vysokou afinitu k Fc receptorům na fagocytech, zatímco IgG2 vykazuje velmi nízkou afinitu a IgG4 má střední afinitu k Fc receptorům IgG jsou schopny opustit oběhový systém a vstoupit do tkání. IgG1, IgG3 a IgG4 mohou procházet placentární bariérou a poskytovat ochranu novorozencům. IgG účinně aktivují systém komplementu a jsou velmi účinné při opsonizaci pomocí Fc receptorů na fagocytech. Prostřednictvím své Fc oblasti se IgG může také vázat na buňky přirozených zabíječů a podílet se na cytotoxicitě závislé na protilátkách. Poločas rozpadu IgG se v závislosti na jeho podtřídě pohybuje od 7 do 23 dnů.

IgM

Tato třída imunoglobulinů se jako první vytváří v reakci na infekci a nachází se buď na membránách B-buněk, nebo jako 5subjednotková makromolekula vylučovaná plazmatickými buňkami. Je to také první třída imunoglobulinů, která je syntetizována novorozenci. Povrchový IgM se od vylučované formy liší svou Fc oblastí. Povrchový IgM se váže přímo jako integrální membránový protein a ne na Fc receptor IgM. Vylučovaný IgM je pentamerická molekula, kde je více imunoglobulinů kovalentně spojeno disulfidovými vazbami. Tato struktura poskytuje více vazebných míst. Každý monomer se skládá ze dvou lehkých řetězců (κ nebo λ) a dvou těžkých řetězců. Díky své pentamerické povaze je IgM obzvláště vhodný k aktivaci komplementu a vyvolání aglutinace. Poločas rozpadu IgM je přibližně 5 dní.

Obrázek 4. Protilátky pouze proti těžkým řetězcům.

Protilátka proti žralokům s těžkým řetězcem (IgNAR) a protilátka proti velbloudům s těžkým řetězcem (hclgG) ve srovnání s běžnou protilátkou (IgG). Těžké řetězce jsou zobrazeny tmavším odstínem, lehké řetězce světlejším odstínem.

Související produkty

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch