MALDI-TOF charakterizace funkcionalizovaných polymerů

Molly E. Payne, Scott M. Grayson

Department of Chemistry, Tulane University, New Orleans, Louisiana

S rostoucí poptávkou po vysoce výkonných a specializovaných polymerních materiálech se do popředí zájmu syntetického vývoje dostaly nástroje pro selektivní funkcionalizaci a modifikaci koncových skupin. Díky svým laditelným fyzikálním a chemickým vlastnostem jsou polymery základní složkou pro různé  materiály¹, biokonjugace², makromonomery³ a biomedicínské materiály⁴.

Vzhledem k jejich složitosti a funkčním částem je mnoho cílových komplexů (např, biologicky aktivních materiálů) jsou neslučitelné s polymeračními podmínkami. Pro zmírnění těchto problémů byla vyvinuta řada syntetických metodik pro účinnou postpolymerizační konjugaci. Například se k polymerům často přidávají koncové skupiny pro použití ve vysoce účinných spojovacích reakcích, jako je azido-alkynová spojka⁵ a thiol-enová spojka⁶.

MALDI-TOF MS pro charakterizaci polymerů

Kritické omezení vývoje v oblasti funkcionalizace koncových skupin polymerů spočívá v obtížnosti potvrzení čistoty koncových skupin před a po modifikaci. Moderní charakterizační techniky, zejména hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí s ionizací matrice v čase letu (MALDI-TOF MS), se ukázaly jako neocenitelné při potvrzování věrnosti koncových skupin. MALDI-TOF je měkká ionizační technika, která umožňuje rozlišení jednotlivých n-mérů polymerů v distribuci hmotnostních spekter. Toto rozlišení umožňuje objasnit nejen hmotnostní distribuci a hmotnost opakovacích jednotek, ale také identitu a věrnost koncových skupin.

Charakterizace molekulové hmotnosti

U polymerů s relativně nízkou disperzitou (Đ≤1,3) lze pomocí MALDI-TOF MS přesně určit údaje o hmotnostním rozložení. Průměrná početní molekulová hmotnost (M_n) je hmotnostní průměr vzhledem k počtu molů každé hmotnostní frakce a lze ji vypočítat podle následujícího vzorce:

Mn =	ΣNiMi
	ΣNi

kde N_i .= počet molekul o určité molekulové hmotnosti a M_i = specifická molekulová hmotnost těchto molekul

Hmotnostní průměr molekulové hmotnosti (M_w) je hmotnostní průměr vzhledem k hmotnosti každého hmotnostního zlomku a lze jej vypočítat podle vzorce:

Mw =	ΣN<.sub>iMi2
ΣNiMi

kde N_i .= počet molekul o určité molekulové hmotnosti a M_i = specifická molekulová hmotnost těchto molekul

Šířka rozložení molekulové hmotnosti neboli disperzita (Đ), může být kvantifikována pomocí poměru M_w/M_n.

Charakterizace koncových skupin

Kromě schopnosti kvantifikovat rozložení molekulové hmotnosti polymerů lze MALDI-TOF MS použít také k rozlišení koncových skupin homopolymerů. Toho lze dosáhnout přeskládáním následujícího vzorce pro pozorovanou hmotnost n-meru v hmotnostním spektru (M_n-mer):

M_n-mer = n(M_RU) + M.sub>EG1 + M_EG2 + M_ion kde n = stupeň polymerace,

M_EG1 = hmotnost α-koncové skupiny,

M_EG2 = hmotnost ω-koncové skupiny,

M_RU = hmotnost opakovací jednotky polymeru

a M_iontu = hmotnost iontu, který s polymerem komplexuje.

MALDI-TOF charakterizace komerčně dostupných materiálů

Komerčně je k dispozici široká škála hotových funkcionalizovaných polymerů pro biomedicínské aplikace, jako je PEGylace, syntéza hydrogelů, cílené podávání léčiv a biokonjugace. Pomocí MALDI-TOF jsme ověřili disperzitu a funkčnost vybraných vysoce definovaných funkcionalizovaných materiálů, které jsou v současné době k dispozici. Všechna níže uvedená spektra MALDI-TOF zobrazují celé spektrum s vloženým jednotlivým n-merem. Naše výsledky ověřují jak úzkou disperzitu těchto materiálů, tak identitu a stupeň funkcionalizace těchto vybraných materiálů.

Product 689696: Bis-azid poly(ethylenglykolu) (M_n=2000)

Obrázek 1. Vizuální pozorování spekter potvrzuje, že polymer má úzkou, monomodální distribuci. Distribuce molekulových hmotností tohoto polymeru byla vypočtena jako Mn: 1940 a Mw: 1950, což vede k úzkému rozdělení s Đ = 1,01. Píky ve spektru odpovídají jedinému rozložení, přičemž každý pík je oddělen 44,026 hmotnostní jednotky, což naznačuje, že v tomto vzorku existuje pouze jedna sada koncových skupin. Koncové skupiny lze ověřit při pohledu na jednotlivé n-mery, jako je například 41-mer [Obrázek 1b]. Teoretická hodnota hmotnosti 42-meru se dvěma azidovými koncovými skupinami je 1984,13978, která byla vypočtena vynásobením hmotnosti opakovací jednotky (44,02621) počtem opakovacích jednotek (42), přičtením hmotnosti azidové koncové skupiny (42,00922), přičtením hmotnosti azidoethylové koncové skupiny (70,04052) a nakonec přičtením hmotnosti sodného kationtu (22,98922). Pozorovaná hodnota pro 42-mer je 1983,95, což se od teoretické hodnoty liší o 0,19 Da.

Produkt 747386: Poly(L-laktid), zakončený thiolem (M_n=2 500)

Obrázek 2. Vizuální pozorování spekter potvrzuje, že polymer má úzkou, monomodální distribuci. Rozložení molekulových hmotností tohoto polymeru bylo vypočteno takto: Mn: 2300, Mw: 2350 a Đ =1,02. Hlavní píky ve spektrech odpovídají jediné distribuci, přičemž každý pík je oddělen 72,021 hmotnostní jednotkou, což naznačuje, že v tomto vzorku existuje pouze jedna sada koncových skupin. Koncové skupiny byly ověřeny pohledem na jednotlivé 26-mery [Obrázek 2b]. Teoretická hodnota hmotnosti 26-meru s koncovými skupinami -hydroxy a ω-thiol je 1973,55254, což se liší o 0,07 Da od pozorované hmotnosti 1973,62 Da. Mezi všemi hlavními píky v tomto materiálu se vyskytují velmi malé píky. Pokud se konkrétně podíváme na menší píky pozorované ve vloženém obrázku, pík o hmotnosti 2045,74 odpovídá 27-meru polymeru a pík o hmotnosti 2057,73 odpovídá polymeru zakončenému karboxylovou kyselinou (místo thiolové funkce). Tyto drobné nečistoty jsou pravděpodobně způsobeny buď iniciací vody při polymeraci otevírající kruh monomeru laktidu, nebo transesterifikací.

MALDI-TOF charakterizace polymerů po konjugačních reakcích

Ačkoli se k usnadnění konjugace polymerů používá mnoho typů reakcí, click reakce jsou široce využívány díky své snadnosti, účinnosti a široké kompatibilitě funkčních skupin. Mědí katalyzovaná azido-alkynová cykloadice (CuAAC)⁵ zpopularizovaná Sharplessem a spol.⁷ konjuguje alkynové činidlo s azidovým činidlem za vzniku 1,2,3-triazolového kruhu. Bertozziho skupina vyvinula kmenem podporovanou alkyno-azidovou cykloadici (SPAAC)⁸ mezi azidovým a cyklooktenovým činidlem jako alternativu bez použití mědi pro použití s živými buňkami a in vivo. Thiol-enové click reakce⁶ mezi alkenem a thiolovým činidlem za vzniku alkylsulfidu jsou rovněž užitečnou bezkovovou alternativou díky své kompatibilitě pro řadu aplikací, zejména biologických. Kromě toho, protože aminy jsou v přírodě a biologii všudypřítomné, jsou amidační reakce⁹ mezi karboxylovými kyselinami a aminy zvláště důležité při syntéze peptidů, proteinů a jejich konjugátů.

Ačkoli se click reakce vyznačují vysokou konverzí, potvrzení dokončení reakce může být u polymerních konjugačních reakcí obtížné. Vzhledem k nízké relativní koncentraci nově vytvořené vazby ve srovnání s polymerními opakovacími jednotkami mohou být tradiční charakterizační metody (např, ¹H NMR) obvykle nejsou pro ověření dostatečně citlivé. Naproti tomu MALDI-TOF lze použít k rozlišení koncových skupin a potvrzení dokončení reakce. Níže uvedené příklady představují dva různé typy click reakcí a potvrzují, že vznikla požadovaná sloučenina. Spektra MALDI-TOF uvedená pro každou reakci ukazují spektrum výchozího materiálu nahoře a konečného produktu dole.

Modifikace poly(ethylenglykol) bis-azidu (produkt 689696) s 1-ethynyl-4-fluorobenzenem pomocí CuAAC

Obrázek 3. Zobrazuje MALDI-TOF spektra polyoxyethylen bis(azidu) (Mn=2000) (červená) modifikovaného 1-ethynyl-4-fluorobenzenem pomocí azido-alkynové cykloadice (modrá). Vizuální pozorování spekter potvrzuje, že došlo k modifikaci, ale lze to potvrdit i na základě rozdílu hmotností mezi vybranými n-mery. Jak ukazuje černá šipka, mezi výchozím materiálem a produktem je pozorován posun o 240,21 Da. To odpovídá rozdílu 42-meru výchozího materiálu (1983,95) oproti 42-meru produktu (2224,16) a je v těsné shodě s teoretickým přesným hmotnostním rozdílem 240,08.

Modifikace thiol-terminovaného poly(L-laktidu)(Product 747386) s 2,5-pyrroledionem pomocí thiol-enové click reakce

Obrázek 4. Zobrazuje MALDI-TOF spektra thiol-terminovaného poly(L-laktidu) (fialová) modifikovaného 2,5-pyrroledionem (zelená) prostřednictvím thiol-enové vazby. Vizuální pozorování celých spekter potvrzuje, že výchozí materiál prošel určitým typem modifikace, ale dokončení thiol-enové reakce lze potvrdit zkoumáním posunu jednotlivých n-mérů. Černou šipkou je naznačen posun o 97,02 Da z 26-meru výchozího materiálu (1973,55) na 26-merový produkt (2214,56), což odpovídá hmotnostnímu posunu, který by se dal očekávat po thiol-enové reakci.

Závěr

Komerčně dostupné polymery s různou molekulovou hmotností, složením a funkčností koncových skupin se staly důležitou součástí mnoha aplikací. S vhodnou koncovou skupinou mohou funkcionalizované polymery poskytnout rychlou a účinnou cestu pro syntézu široké škály polymerních konjugátů. Vzhledem k tomu, že složitost těchto materiálů se pro potřeby výzkumných pracovníků zvyšuje, je MALDI-TOF MS cenným nástrojem pro potvrzení identity koncových skupin a transformací a ověření úspěšné a úplné konjugace.

Odkazy

1. Brinson HF, Brinson LC. 2008. Polymer Engineering Science and Viscoelasticity. https://doi.org/10.1007/978-0-387-73861-1

2. Lutz J, Börner HG. 2008. Modern trends in polymer bioconjugates design. Progress in Polymer Science. 33(1):1-39. https://doi.org/10.1016/j.progpolymsci.2007.07.005

3. Plate N, Valuyev L, Chupov V. 1985. Synthesis and polymerization of macromonomers based on physiologically active compounds. Review. Polymer Science U.S.S.R.. 27(10):2265-2282. https://doi.org/10.1016/0032-3950(85)90302-8

4. Green JJ, Elisseeff JH. 2016. Mimicking biological functionality with polymers for biomedical applications. Nature. 540(7633):386-394. https://doi.org/10.1038/nature21005

5. Meldal M, Tornøe CW. 2008. Cu-Catalyzed Azide?Alkyne Cycloaddition. Chem. Rev.. 108(8):2952-3015. https://doi.org/10.1021/cr0783479

6. Hoyle C, Bowman C. 2010. Thiol-Ene Click Chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 49(9):1540-1573. https://doi.org/10.1002/anie.200903924

7. Rostovtsev V, Fokin V, Sharpless Angew KB. 2002.(41):2596-2599.

8. Baskin JM, Prescher JA, Laughlin ST, Agard NJ, Chang PV, Miller IA, Lo A, Codelli JA, Bertozzi CR. 2007. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104(43):16793-16797. https://doi.org/10.1073/pnas.0707090104

9. Montalbetti CA, Falque V. 2005. Amide bond formation and peptide coupling. Tetrahedron. 61(46):10827-10852. https://doi.org/10.1016/j.tet.2005.08.031