ZHÁŠEČ ČERNÝCH DĚR™ (BHQ™)

 

Black Hole Quencher™

Dva běžně používané zhášeče, TAMRA™ a DABYCL, omezují maximální citlivost a flexibilitu qPCR. TAMRA není temný zhášeč, a proto přispívá k celkovému zvýšení pozadí kvůli své vlastní nativní fluorescenci. DABCYL je sice tmavý zhášeč, ale má nedostatečnou absorpční stopu, která se velmi špatně překrývá s reportérovými barvivy emitujícími nad 480 nm (obrázek 2).

Obrázek 2. Absorpční spektra DABCYL-T9 s emisními spektry běžně používaných reporterů 6-FAM™, TET™ a JOE™. DABCYL byl normalizován na absorbance poly-T (260 nm). RFU = relativní fluorescenční jednotka.

Ačkoli DABYCL funguje dobře v molekulárních majácích (strukturované sondy s párovým reportérem a zhášečem, které využívají statické zhášení), jeho absorpční maximum 474 nm ho řadí pod maxima reportérů zobrazených na obrázku 2, a proto není vhodnou volbou pro duálně značené sondy (lineární sondy s odděleným reportérem a zhášečem, které využívají zhášení FRET).

Black Hole Quencher™ 1 (BHQ™-1) (s absorpčním maximem 534 nm) je absorbován při vyšších vlnových délkách než DABCYL a je přímo superponovatelný s emisními maximy FAM, TET a JOE. To zajišťuje výrazné zvýšení účinnosti statického zhášení i zhášení FRET, což z něj činí vynikající zhášeč pro molekulární majáky a duálně značené sondy. Jak je znázorněno na obrázku 3, BHQ™-1, BHQ™-2 a BHQ™-3 pokrývají spektrum od 480 nm do blízkého infračerveného záření, což umožňuje použít reportery, které emitují kdekoli v tomto rozsahu.

Obrázek 3. Absorpční spektra tří variant BHQ™ (konjugovaných s T-9 a normalizovaných na absorbanci poly-T 260 nm) s emisními maximy běžně používaných reporterů 6-FAM, TET, HEX™, cyanin 3, TAMRA, ROX™, LC Red 640 a cyanin 5.

Kromě lepšího spektrálního překryvu mají sondy BHQ™ mnohem vyšší poměr signálu k šumu ve srovnání s odpovídajícími sondami DABCYL nebo TAMRA (obrázek 4).

Obrázek 4. Poměr signálu k šumu (S:N) byl vypočten vydělením fluorescenčního signálu 25meru v přítomnosti pětinásobného přebytku přesné komplementární cílové sekvence intenzitou fluorescence samotné sondy.

Nakonec, jak ukazuje obrázek 5, varianty BHQ™ snadno umožňují multiplexování v jedné zkumavce díky většímu množství reporterů, které mohou být účinně zhášeny s malým nebo žádným vzájemným ovlivňováním. To zjednodušuje návrh, provádění a interpretaci multiplexovaných testů.

Obrázek 5. Jedinečné vlastnosti variant BHQ™ umožňují flexibilitu při výběru spektrálně dobře rozlišitelných reporterů, které umožňují multiplexování v jedné zkumavce s malým nebo žádným vzájemným přeslechem.

Shrnuto a podtrženo, Black Hole Quencher™:

• Nemá nativní fluorescenci (místo světla vyzařuje teplo), což vede k nižší fluorescenci pozadí
• Má zvýšený poměr signál/šum, což poskytuje vyšší citlivost
• Umožňuje širší výběr reportérů pro multiplexování