Experimentální design a analýza - Nejčastější dotazy k experimentálnímu designu

Jaké kontroly doporučujete?

Při provádění experimentů s použitím konstruktů shRNA MISSION® TRC by měly být klíčovým prvkem vašeho experimentálního návrhu správné kontroly, aby bylo možné přesně interpretovat výsledky knockdownu. Všechny kontroly jsou k dispozici jak ve formátu purifikované plazmidové DNA, tak ve formátu lentivirových částic.

K optimalizaci účinnosti transdukce při prvním použití buněčné linie mohou navíc sloužit kontrolní transdukční částice MISSION® TurboGFP (č. výrobku  SHC003V).

Námi doporučené kontroly pro experimenty s shRNA jsou uvedeny v tabulce Výběr kontrol.

Nejvhodnější negativní kontrolou je buď kontrola MISSION® necílová shRNA, nebo kontrola prázdného vektoru (č. produktu  SHC002/SHC002V nebo SHC001/SHC001V).

Proč necílový kontrolní vektor neovlivňuje genovou expresi?

Necílový kontrolní vektor (č. produktu  SHC002, SHC002V) má v rámci shRNA nejméně 5 bp neshod s jakýmikoli známými lidskými nebo myšími geny, což omezuje jeho schopnost cílit na jakékoli lidské nebo myší geny. Sekvenci vlásenek a mapu vektoru naleznete v seznamu produktů 

.

Kolik buněk mohu infikovat dodaným množstvím lentiviru?

Množství buněk, které lze infikovat, závisí na použité buněčné linii. Pro buňky HeLa, A549 a HEK293T jsme použili 4 µl (1 x 106 TU/ml pomocí testu p24) pro každou jamku obsahující ~16 000 buněk v 96jamkové destičce. Primární nebo jiné obtížné buňky mohou vyžadovat více lentivirového supernatantu, ale i 10 µl by vám stačilo na 20 x 96jamkových reakcí. V případě potřeby doporučujeme snížit počet nanášených buněk, aby se zvýšila multiplicita infekce (MOI). Také provedení titru limitního ředění na vaší buněčné linii vám poskytne optimální množství virových částic potřebných pro každou zkoušku.

Jakou metodu doporučujete pro screening stabilních klonů a existuje pár primerů, které lze použít pro jejich screening pomocí PCR?

Nejlepším přístupem je screening knockdown pomocí primerů navržených proti genu, který vás zajímá. Klon rezistentní vůči puromycinu lze prověřit pomocí qRT-PCR s použitím primerů navržených proti PAC nebo cílovému genu zájmu.

Proč po selekci puromycinem nepřežily žádné buňky?

Buňky, se kterými pracujete, mohou být citlivé na puromycin. Koncentrace puromycinu přidaná k buňkám může být příliš vysoká. Pro každý nový typ použitých buněk se doporučuje provést titraci puromycinu, aby se určila nejnižší koncentrace puromycinu potřebná k účinnému výběru transfekovaných nebo transdukovaných buněk. Před aplikací antibiotik na buňky nezapomeňte počkat 48 hodin po transdukci. Případně může být pro účinnou transdukci zapotřebí vyšší MOI nebo metody pro zvýšení transdukce, jako je ExpressMag® 

.

Jak by měla být nastavena titrace puromycinu (křivka usmrcení)?

1. Do jamek 96jamkové destičky se 120 ml čerstvého média rozdělte 1,6 x 104 buněk.
2. Druhý den přidejte do vybraných jamek 500-10 000 ng/ml puromycinu.
3. Každé 2 dny vyšetřete životaschopnost.
4. Kultivujte 10-14 dní. Každé 3 dny vyměňte médium obsahující puromycin.
5. Pro daný typ buněk by měla být použita minimální koncentrace puromycinu, která způsobí úplnou smrt buněk po 3-5 dnech.

Kolik virů budu potřebovat?

Množství viru potřebné k účinné transdukci dané buněčné linie musí být stanoveno empiricky. Pokusili jsme se to našim zákazníkům usnadnit tím, že jsme uvedli tabulku navrhovaných podmínek transdukce pro různé buněčné linie/typy. Pokud vaše buněčná linie není v tomto seznamu uvedena, doporučujeme provést titraci viru a určit nejvhodnější množství potřebné pro vaše buňky. Doporučujeme počáteční pokusy o optimalizaci viru v rozmezí MOI 0,5 - 20x. Při překročení tohoto rozmezí může být lentivirus pro některé buněčné linie toxický. Přesto se objevily zprávy o výzkumech používajících velmi vysoké koncentrace viru s MOI až 100x. Tyto extrémní hodnoty MOI často vyžadují vyšší titry viru, kterým se můžeme na požádání přizpůsobit.

Jak mohu provádět screening se sdruženými knihovnami/panely shRNA?

Při screeningu je důležité mít k dispozici redundantní shRNA vykazující stejný fenotyp, čímž se zmírní potenciální komplikace způsobené účinky mimo cíl. Pro využití sdružené knihovny LentiPlex je zapotřebí pět základních kroků.

1. Optimalizace puromycinových selekčních podmínek
2. Optimalizace účinnosti transdukce
3. Transdukce a selekce cílových buněk pomocí knihovny shRNA Mission® LentiPlex Pooled Library
4. Výběr cílových buněk pomocí knihovny shRNA LentiPlex./li>
5. PCR amplifikace
6. Identifikace pozitivních zásahů pomocí sequncingu

Informace o identifikovaných sekvencích TRC shRNA a příslušných cílových genech lze snadno nalézt na stránkách Your Favorite Gene (YFG).

Jak mohu provést screening knihoven shRNA s maticemi?

Při screeningu je důležité mít k dispozici redundantní shRNA vykazující stejný fenotyp, čímž se zmírní potenciální komplikace způsobené účinky mimo cíl. Jiní poskytovatelé RNAi mohou nabízet menší knihovny sdružených shRNA zaměřených na jednotlivé geny. Náš výzkum však ukázal, že sdružování na úrovni genů představuje tři potenciální nebezpečí: (1) ztlumení funkčního nebo fenotypového účinku, (2) generování většího počtu falešně pozitivních stop a (3) nemožnost vyloučit možné off-target efekty.

Kde lze zakoupit protilátky proti puromycinu?

Pokud reference uvádí, že anti-PAC byla použita k detekci virové integrace, znamená to, že tuto protilátku vyrobili ve svých laboratořích.

Jaké jsou výhody selekce pomocí antibiotik oproti fluorescenčnímu třídění pomocí GFP?

Selekci transdukovaných buněk lze provést buď pomocí puromycinu, nebo pomocí FACS při výběru expresorů tGFP. Obě možnosti jsou přitom účinné. Pro zcela čisté populace transdukovaných buněk se však doporučuje selekce pomocí puromycinu.

Jaké alternativy jsou k dispozici v případě buněčné linie citlivé na polybren?

Ano, pro některé buněčné linie může být polybren toxický. Některé laboratoře začaly místo něj používat fibronektin. Na druhou stranu, polybren mnohdy pouze zvyšuje knockdown a nemusí být zcela nezbytný. ExpressMag je alternativou k použití polybránu a může výrazně zvýšit účinnost transdukce. Pokud jsou buňky suspenzní, mohla by dobře fungovat i nějaká verze Spinfection.

Mohu umlčet více genových cílů současně?

Existuje několik přístupů, jak se pokusit cílit na více genů najednou, ale nezapomeňte, že všechny konstrukty obsahují stejný selekční marker (puromycin). Z tohoto důvodu neexistuje jasný způsob, jak určit (ještě v kultuře), které buňky dostaly oba typy virů. Můžete provést transdukci směsí dvou cílových shRNA, nebo můžete provést sériovou transdukci, kdy provedete transdukci jednou shRNA a druhý den další. Jediný způsob, jak prověřit pozitivní výsledky, by byla qPCR nebo jiná metoda analýzy (selekce by nebyla dostatečná).

Kolik kopií/buňku mohu očekávat?

Odpověď není jednoznačná. Některé buněčné linie vyžadují větší dávku viru (multiplicita infekce). Mnoho výzkumníků se snaží vložit pouze jednu kopii na buňku, a to je třeba stanovit empiricky pro každou buněčnou linii. Řadu buněk jsme již ověřili, viz tabulka buněk.

Je při transdukci nejlepší snížit objem média na buňkách?

Mnozí výzkumníci dávají při transdukci přednost snížení objemu média na buňkách, protože to nemá negativní vliv na jejich buněčnou linii. Snížení objemu může zvýšit celkovou koncentraci lentiviru na buňkách, a tím potenciálně zvýšit účinnost transdukce.

Jakou dobu knockdownu mohu očekávat u shRNA?

Teoreticky by výroba shRNA a knockdown měly být trvalým stavem. U buněk, které byly transdukovány a kultivovány déle než 1 rok, pozorujeme stabilní a trvalé knockdown. Tyto kultury byly vypěstovány z jediné rezistentní buňky (klonální selekce). Pozorovali jsme, že populace buněk, které neprošly klonální selekcí, se v průběhu času mění, což je někdy interpretováno jako změna knockdownu. Ve skutečnosti dochází k tomu, že v rámci heterogenní populace buněk dochází k různým účinkům knockdownu. Jak si dokážete představit, některé buňky mohou ve svém růstu předstihnout jiné, a v důsledku toho se procento knockdownu, které je pozorováno, v průběhu času mění podle toho, jak se mění populace buněčné kultury.

Jak mohu vizualizovat buňky a infikovat je shRNA?

Máme skvělý vektor, který exprimuje jak tGFP, tak shRNA řízenou U6, do kterého můžeme naklonovat jakoukoli TRC nebo shRNA odvozenou od zákazníka. Toto přizpůsobení spolu s mnoha dalšími vektory je k dispozici na našich vylepšených webových stránkách.

Jak mohu pomocí imunohistochemie sledovat začlenění lentivirového vektoru-siRNA do buněk? Mohu použít nějaké protilátky proti části viru? Máte nějaké reportérové geny, jako je GFP, nebo značení siRNA, jako je Cy3? Existují jiné metody, které mohu použít k prokázání inkorporace lentivirového vektoru?

Existuje mnoho způsobů, jak ověřit, že se shRNA do buněk dostala. Každý z konstruktů MISSION®-TRC nese gen rezistence vůči puromycinu (PAC). Buňky lze sledovat pomocí protilátky anti-PAC nebo selektovat pomocí puromycinu. Přeživší buňky exprimují shRNA. Buňky lze také sledovat pomocí qRT-PCR s použitím sond proti genu PAC. Nabízíme kontrolní reportér pro fluorescenční vizualizaci buněk (MISSION® TurboGFP Control Transduction Particles - SHC003V).

Mohu shRNA na stejný gen spojit?

Ano, shRNA můžete sdružovat na úrovni genů, rodin nebo dokonce genomu. Ve skutečnosti nabízíme celogenomový sdružený screening nazvaný LentiPlex, který je připraven k použití. Přesto se sdružování na nižší úrovni (tj. na úrovni genů) nedoporučuje. Jednotlivé, špatně fungující klony mohou drasticky změnit expresi a fenotyp, což může vést k falešně negativním výsledkům.