esiRNA FAQ (často kladené otázky)
MISSION® esiRNA jsou siRNA připravené endoribonukleázou, které se skládají z heterogenní směsi siRNA, jež všechny cílí na stejnou sekvenci mRNA. Tyto vícenásobné spouštěče umlčování vedou k vysoce specifickému a účinnému umlčování genů. Zde jsou některé z nejčastěji kladených otázek týkajících se použití a dostupnosti esiRNA.
Co když můj oblíbený gen není na seznamu jednotlivých esiRNA?
Na základě aktualizovaných anotací genomu a ověřování exprese neustále přidáváme nové individuální esiRNA. Pro transkripty, které nejsou pokryty, nabízíme esiRNA na míru (tato možnost produktu se nazývá, esiOPEN), které jsou plně flexibilní z hlediska druhu a cílové sekvence. Pro proces návrhu esiOPEN je vyžadován cíl o minimální délce 500 bp.
Jsou k dispozici esiRNA pro jiné druhy než pro člověka nebo myš?
Ano, nabízíme esiRNA na zakázku (tato možnost produktu se nazývá, esiOPEN), které jsou nezávislé na původu sekvencí. Musíte pouze poskytnout cílovou sekvenci o minimální délce 500 bp.
Cílí esiRNA na všechny varianty transkriptu cílového genu?
Ano, esiRNA jsou navrženy pro oblast cíle, která je společná všem variantám transkriptu. Ve vzácných případech se však varianta výrazně liší od všech ostatních, takže nelze najít žádnou společnou oblast. V těchto případech se nabízejí dvě esiRNA: jedna, která cílí na transkripty se společnou oblastí, a druhá, která cílí na variantu nepokrytou první esiRNA.
Jsou k dispozici esiRNA, které cílí na jednotlivé varianty transkriptu stejného genu nezávisle?
Ano, nabízíme esiRNA na míru (tato možnost produktu se nazývá, esiOPEN) pro jakoukoli cílovou oblast. Pro proces návrhu esiOPEN je vyžadován cíl o minimální délce 500 bp. Proto se cílová varianta musí lišit od ostatních variant alespoň o těchto 500 bp, aby byla specifická.
Jak mohu ověřit pozorovaný fenotyp RNAi?
RNAi fenotypy lze ověřit pomocí nezávislých sekundárních esiRNA, které se zaměřují na jinou oblast transkriptu než primární esiRNA. EsiRNA pro tento účel jsou k dispozici jako volitelný produkt s názvem, esiSEC.
Co lze dělat, pokud není srážka dostatečně silná?
Možným důvodem slabého knockdownu je nízká účinnost knockdownu. Optimalizace reakce by měla být provedena pomocí křivky dávka-odpověď pro transfekční činidlo a esiRNA. Množství transfekčního činidla by mělo být stanoveno pomocí negativní kontroly, například Renilla Luciferázy (RLUC). Pro ověření účinnosti knockdownu použijte pozitivní kontrolu, např. Eg5, a proveďte fenotypovou analýzu mitotické zástavy (zakulacené buňky) nebo analýzu qPCR. Počet buněk musí být u všech transfekcí stabilní, protože rozdíly oproti optimalizovaným podmínkám ovlivní účinnost knockdownu nebo způsobí cytotoxické účinky.
Pokud byla transfekce optimalizovaná a kvalitní, může k neuspokojivé depleci cílového proteinu vést mnoho dalších důvodů. U proteinů, které mají pomalý obrat, lze maximální depleci očekávat 96 hodin po transfekci, např. podjednotka APC Cdc27. Pokud se buněčná linie dělí pomalu, může to také vést k delšímu zpoždění knockdownu. Pokud je rychlost obměny proteinů vysoká, lze depleci očekávat 48 hodin po transfekci, např. motorický protein Eg5. Měření je proto třeba provádět ve správném časovém okamžiku. V některých případech, pokud nelze vysvětlit nízkou účinnost knockdownu, však může být vhodné vyzkoušet nezávislou, sekundární esiRNA (tato možnost produktu se nazývá, esiSEC), která bude cílit na jinou oblast v mRNA.
Mohu použít stejný protokol pro transfekci siRNA a esiRNA?
Ne, transfekce siRNA a esiRNA je sice srovnatelná, ale není totožná. Protokol transfekce siRNA může sloužit jako výchozí bod pro samostatný proces optimalizace esiRNA. Buněčné linie mají různé vlastnosti a jsou citlivé nebo necitlivé na různé manipulace. To jistě platí i pro transfekce. Proto je třeba pro každou buněčnou linii stanovit vhodný transfekční protokol zvlášť. Cílem optimalizace transfekce je dosáhnout maximální účinnosti transfekce při minimální cytotoxicitě.
Níže jsou uvedeny podmínky transfekce esiRNA pro některé běžně používané buněčné linie. Uvedené hodnoty by měly sloužit pouze jako vodítko (v případě použití jiných formátů destiček je třeba provést podrobnou optimalizaci). Pro optimalizaci doporučujeme použít esiRNA pro Eg5 (KIF11) a Renilla luciferázu (RLUC) jako pozitivní, resp. negativní kontrolu. Eg5 (KIF11) indukuje mitotickou zástavu s tvorbou buněk kulatého tvaru, které se po několika hodinách zástavy stávají apoptotickými. Tyto kulaté buňky lze snadno pozorovat ve standardním mikroskopu s jasným polem pro kultivaci buněk. Podmínky s maximálním počtem kulatých buněk pro transfekci Eg5 s minimální cytotoxicitou pro transfekci RLUC znamenají optimální podmínky transfekce.
Figure 1: RLUC
Figure 2:mitotic arrest
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?