Bezpečná manipulace s lenvirem

Často kladené otázky a bezpečnostní vlastnosti lentivirů

Naše lentivirální vektorové systémy byly vyvinuty s vylepšenými bezpečnostními vlastnostmi. Při konstrukci našich lentivirových virů jsou zavedena četná bezpečnostní opatření, která zabraňují replikaci, včetně eliminace genů virulence a rozdělení klíčových genů mezi různé vektory. Přesto je nutné dodržovat zásady správného zacházení.  Přečtěte si další informace o nejčastějších dotazech týkajících se bezpečného používání lentivirů.

Pro zajištění bezpečnosti lentivirů byly odstraněny čtyři virové akcesorní geny a zůstal minimální počet genů potřebný k vytvoření lentivirálních částic s omezenou replikací. Ty byly rozděleny do více plazmidů: 3 pro balicí systémy 2. generace a 4 pro balicí systémy 3. generace. To znamená, že by muselo dojít ke 3 nebo 4 rekombinačním událostem současně, aby vznikly lentivirové viry schopné replikace.

Vektory pro výrobu lentivirových virů

	Druhá generace	Třetí generace
Plasmidy	3	4
U3 Delece v 3'LTR - samoinaktivace (SIN)	Ne	Ano
5' LTR	divoký typ 5'LTR	Chimerický RSV
Pakovací plazmidy	1	2
Přídavné geny: vif, vpr, vpu, nef	Všechny nepřítomny	Všechny nepřítomny
tat a rev geny	Na jednom obalovém plazmidu	Tat je vyloučen.  Rev je na vlastním obalovém plazmidu
gag a pol geny	Společně na stejném plazmidu jako tat a rev	Společně na jednom plazmidu
Pseudotypizovaný nebo WT obalový protein	Pseudotypovaný (VSV-G)	Pseuodotypovaný (VSV-G)
Rekombinační události potřebné k vytvoření replikačně kompetentních lentivirů (RCL)*<	3 rekombinace	4 rekombinace

Níže se zabýváme některými běžnými obavami ohledně bezpečnosti lentivirových virů. V případě dalších otázek a diskuze nás prosím kontaktujte.

Obrázek 1. Balení lentivirových virů

Z důvodu vyšší bezpečnosti jsou strukturní a pomocné geny nezbytné k produkci virových částic odděleny na více plazmidech. Všechny virulenční a replikační geny divokého typu jsou odstraněny. Všechny lentivirové přenosové vektory Sigma-Aldrich^® obsahují modifikovanou, samoinaktivující se 3' dlouhou terminální repetici (SIN/LTR), která způsobuje, že výsledné lentivirové částice nejsou replikačně schopné. Lentivirální částice se balí do produkčních buněčných linií, jako jsou buňky HEK293T. Po ko-transfekci plazmidů jsou k dispozici všechny požadované sekvence pro výrobu a balení virové částice obsahující transgen, který je předmětem zájmu. V rámci virové kapsidy je zabalena pouze oblast mezi virovými LTR přenosového vektoru.

Často kladené otázky týkající se bezpečnosti lentivirů

Jak závažné jsou obavy z biologické bezpečnosti lentivirů? Existuje reálné riziko nákazy virem HIV?"

Virové vektorové systémy byly vyvinuty se zvýšenými bezpečnostními prvky, jak je popsáno výše. Výsledné částice jsou replikačně nekompetentní a delece v části U3 3' LTR eliminuje promotorovou oblast, čímž se dále neguje možnost virové replikace. Ze systému byly rovněž odstraněny geny virulence, které nejsou pro balení viru nezbytné. Kombinace těchto vlastností zlepšila biologickou bezpečnost a manipulaci. Doporučuje se používat přenosový vektor třetí generace pro jeho lepší biologickou bezpečnost. Přestože není zdokumentován žádný výskyt přenosových vektorů třetí generace, které by produkovaly replikačně kompetentní virus, je důležité při rutinním balení lentivirů sledovat replikační kompetenci. Pokyny NIH doporučují, aby se s lentivirovými částicemi nekompetentními k replikaci zacházelo jako s částicemi rizikové skupiny 2 (RGL2). Další opatření mohou být vyžadována na základě místních, státních nebo národních předpisů.

Může lentivirus projít hematoencefalickou bariérou (BBB)?

Vzhledem k velikosti částic a současnému pseudotypu VSV-G se nepředpokládá, že by lentivirus prošel BBB (ačkoli nemáme k dispozici údaje, které by toto tvrzení potvrzovaly). Více výzkumníků zaměřených na oblasti mozku prokázalo, že optimální je přímá kraniální injekce.

Je vektor pLKO.1 vektorem založeným na HIV, a pokud ano, existují nějaké problémy s biologickou bezpečností?

Vektor pLKO.1 a jeho deriváty jsou plazmidy založené na lentivirech (HIV). Lentivirus je považován za materiál úrovně biologické bezpečnosti 2 a je bezpečný pro použití díky svým modifikovaným vlastnostem (odstranění řady akcesorních genů virulence , minimální genom virových částic, nereplikující se a samoinaktivační vlastnosti), díky nimž není schopen produkovat virus po infikování do hostitelské buňky. Konkrétní požadavky konzultujte s pracovníkem pro biologickou bezpečnost ve vaší instituci.

Jak mohu minimalizovat dopad na životní prostředí a regulační rizika?

Pro zabránění jakýmkoli formám kontaminace, které by mohly vést k možnosti vzniku viru schopného replikace, jsou nezbytné správné laboratorní postupy. Je nutné testovat replikačně kompetitivní virus. Vzhledem k tomu, že virové strukturní geny byly umístěny na různých genetických jednotkách, musí dojít k několikanásobné rekombinaci, než vznikne replikačně kompetentní pomocný virus. Kromě toho byly minimalizovány oblasti homologie mezi jednotkami exprimujícími proteiny pomocného viru. Rovněž byly použity heterologní promotory pro proteiny pomocného viru. Manipulaci s velkým množstvím viru a koncentrovaným virem by měly upravovat pokyny CDC pro postupy BSL-2+.  Naše výrobní zařízení Sigma Aldrich rutinně provádějí standardizované postupy pro testování spontánní produkce replikačně kompetentního lentiviru (RCV). Za více než deset let výroby na místě jsme nikdy nezaznamenali výskyt replikačně kompetentního viru; údaje jsou k dispozici na vyžádání.  

Co mám dělat s materiálem, který přišel do styku s lenvirem?

Před vyhozením do biologicky nebezpečného odpadu namočte veškerý virus a veškerý technický materiál a špičky, které se dotkly viru nebo buněk obsahujících virus, na 20 minut do 10% bělidla. Konkrétní pokyny konzultujte s pracovníkem pro biologickou bezpečnost ve vaší instituci.

Prosím, kontaktujte nás s jakýmikoliv dalšími dotazy ohledně bezpečného používání lentivirálních vektorů a při vývoji vašeho projektu editace genů.