Antisense oligonukleotidy
Tento článek shrnuje několik běžných mechanismů antisense genové modulace a především úvahy, které je třeba vzít v úvahu při navrhování antisense oligonukleotidu (ASO). Ani po desetiletích výzkumu neexistují žádná pevná pravidla pro návrh; stále se jedná o metodu pokusu a omylu. Existují však pokyny, které je třeba dodržovat a které by měly učinit tento proces zvládnutelnějším.
Přehled sekcí
Pomoc s návrhem
Potřebujete pomoci s návrhem ASO nebo nemůžete najít modifikaci v online konfigurátoru pro objednávání? Náš tým technických služeb vám může pomoci. Zašlete prosím požadavek na adresu [email protected].
Modulační mechanismy
Tradiční genová modulace založená na ASO (obvykle je synonymem pro umlčení nebo snížení exprese genů, ale může být použita ke zlepšení exprese genů a přinejmenším v jednom konkrétním případě bylo prokázáno, že vede ke zvýšení exprese genů) se zaměřuje na mRNA a může probíhat buď v jádře, nebo v cytoplazmě. V jádře (cílem je pre-mRNA) modulace obvykle funguje tak, že přesměruje polyadenylaci1, změní sestřihové děje2 nebo rozštěpí internukleotidové vazby3, k čemuž všemu dochází během zrání mRNA (obrázek 1). V cytoplazmě (cílem je zralá mRNA) funguje modulace obvykle buď translační změnou bez štěpení4, nebo štěpením3, přičemž k oběma dochází těsně před/během translace (obrázek 2).
Obrázek 1. Mechanismy modulace genů v jádře založené na ASO.U savců se gDNA v jádře přepisuje do pre-mRNA. Exogenní ASO v jádře hybridizuje A) na 3'-konečný polyadenylační signál na pre-mRNA a blokuje polyadenylaci v tomto místě, čímž ji přesměruje na jiné místo před jádrem, což zvyšuje expresi genu1 B) na místo sestřihu, čímž zabrání správnému sestavení spliceosomu, což vede k přeskočení exonu, a tedy ke zlepšení exprese chorobného genu2 (mnozí je nepovažují za pravé ASO, často se nazývají splice switching oligonukleotidy [SSO] nebo obecněji sterické blokační oligonukleotidy [SBO]) C) exonu nebo intronu (v tomto případě intronu), čímž dochází ke štěpení RNázou H3. Ve většině případů, i když je výrazně regulována, umlčena nebo změněna, pravděpodobně dojde k určitému zpracování neovlivněné pre-mRNA, po němž následuje export zralé mRNA do cytoplazmy. S = polyadenylační signální sekvence (ačkoli je zde uvedena pouze jedna, v jednom transkriptu jich může být více).
Obrázek 2. Mechanismy modulace genů v cytoplazmě na bázi ASO.V případě savců je gDNA v jádře 1) přepsána na pre-mRNA 2) pre-mRNA je zpracována (je přidán 5' uzávěr a 3' poly[A] ocásek) a sestřihána (jsou odstraněny introny) za vzniku zralé mRNA a 3) zralá mRNA je exportována do cytoplazmy. Exogenní ASO hybridizuje na zralou mRNA v cytoplazmě a umlčuje (snižuje) expresi genu A) změnou translace, v tomto případě inhibicí translace narušením ribozomální sestavy na 5' uzávěru4 (často se nepovažuje za skutečný ASO, jedná se o příklad obecného SBO) nebo B) štěpením RNázou H (konkrétně RNázou H1 u lidí)3. Ve většině případů, i když je výrazně snížena, stále dochází k translaci.
ASO rozpoznávají cílové mRNA a hybridizují s nimi pomocí párování Watson-Crickových bází. ASO, které vedou ke štěpení cílových mRNA RNázou H (ať už v jádře nebo v cytoplazmě3), jsou široce studovány pro výzkumné a terapeutické účely, a proto jsou z hlediska mechanismu modulace nejlépe pochopeny. Pomocí hořečnatých iontů jako kofaktoru štěpí RNáza H (konkrétně RNáza H1 u člověka) vlákno mRNA v heteroduplexu mRNA:DNA hydrolýzou internukleotidové (fosfodiesterové) vazby5. Po štěpení zůstává ASO neporušená, zatímco z bývalé štěpné vazby jsou nyní volné 3'-hydroxylové a 5'-fosfátové skupiny na 5', respektive 3' fragmentu degradované mRNA.
Úvahy o návrhu
V zásadě by mělo být umlčování genů tak jednoduché jako výběr sekvence v cílové mRNA; objednání komplementárního ASO párujícího Watson-Crickovy báze u dodavatele; jeho zavedení do zkoumaného systému (buď in vitro nebo in vivo); a pozorování očekávaného účinku pomocí příslušného reportéru. Pro úspěšný návrh ASO je však třeba vzít v úvahu mnoho aspektů.
Hybridizační místo
Podle pravidel Watson-Crickova párování bází by ASO měl hybridizovat s libovolnou oblastí cílové sekvence mRNA. MRNA se však skládá do sekundárních a dokonce terciárních struktur, které pravděpodobně blokují hybridizaci ASO. Proto by se jako místa hybridizace měly vybírat nesložené oblasti mRNA. Existují metody pro mokré laboratoře, jako je mapování RNázy H, které jsou užitečné pro předpověď přístupného místa6, ale dobrým začátkem je vyzkoušet prediktivní algoritmus skládání RNA, např. mfold.
Po identifikaci neskládané oblasti je třeba sekundárně zvážit, zda oblast slouží jako vazebné místo pro spliceozomy, ribozomy, proteiny nebo jiné makromolekulární sestavy. Historicky byly dobrým výběrem místa 5' čepička, iniciační kodon, 3' nepřekládaná oblast / polyA chvost7. I když ASO neaktivuje RNázu H, může přesto vést k umlčení, protože stericky zablokuje mechanismus potřebný pro zrání mRNA nebo translaci.
Nukleázová degradace
In vivo a in vitro jsou all-nativní DNA ASO rychle znehodnoceny nukleázovou aktivitou. In vivo sice mohou k degradaci vést jak endonukleázy, tak exonukleázy8, ale zdá se, že největší poškození způsobují exonukleázy9,10. Aby byly všechny ASO účinné, vyžadují chemickou modifikaci, aby odolaly degradaci nukleázami. Ačkoli je k dispozici řada analogů nukleových kyselin pro modifikaci ASO5,11, zde uvádíme pouze ty, které jsou součástí naší standardní nabídka modifikací bude prozkoumána (tabulka 1).
Modifikacím podléhají tři oblasti ASO (internukleotidové vazby, cukry a báze) a ve všech následujících částech jsou modifikace klasifikovány podle jejich primárního účinku, i když některé z nich mají více než jeden účinek, např.např. modifikace X primární účinek: zlepšuje vazebnou afinitu; sekundární účinek: snižuje škodlivý vliv imunostimulace (v tomto článku zůstane pozornost zaměřena na primární účinek).
Fosforothioát. Tato modifikace byla jednou z mála, které jsou považovány za první generaci. PS-ASO jsou odolné vůči nukleázám, a proto mají delší poločas rozpadu v plazmě v porovnání s celonativními DNA ASO9. Kromě toho si zachovávají negativní náboje páteře, což usnadňuje vstup PS-ASO do buňky11. Zajímavé je, že PS má zřejmě větší vliv na transport a vstup do buňky než na odolnost vůči nukleázám12.
Naproti tomu PS-ASO nejsou zcela chráněny před nukleázami, mají sníženou hybridizaci k cílovým mRNA (viz oddíl Vazbová afinita) a musí být neustále podávány ve velkém množství, aby byla zachována modulace11. Kromě toho mohou PS interagovat s proteiny in vivo, a vést tak k negativním vedlejším účinkům, včetně aktivity imunitního systému11.
Methyl RNA. Tato modifikace patřila mezi několik málo modifikací, které jsou považovány za druhou generaci. Při kombinaci s PS v ASO bylo zjištěno, že 2'-OMe-RNA zlepšuje výhody samotného PS (tj. zvýšená odolnost vůči nukleázám, plazmatický poločas a absorpce ve tkáních11).
Methoxyethyl RNA. Derivát 2'-Me-RNA, 2'-O-methoxyethyl (2'-MOE), získal v posledních letech popularitu poté, co byl obsažen v několika schválených léčivých přípravcích23. Podobně jako u jiných 2' modifikací ribonukleotidů vede 2'-MOE ke zvýšení stability duplexu při spárování s cílovou RNA.
Fluorová RNA. Nahrazení 2'-hydroxylové skupiny v RNA fluorem podstatně zvyšuje její teplotu tání, chemickou stabilitu a odolnost vůči nukleasám.
Imunostimulace
Bakteriální DNA obsahuje mnohem častěji CpG (cytosin-fosfodiesterová vazba-guanin) dinukleotidy postrádající metylaci než DNA obratlovců. Je to především proto, že dinukleotidy CpG jsou v genomu obratlovců zastoupeny v nedostatečné míře a 80 % z nich je označeno metylovými skupinami13. Vzhledem k tomu, že motiv CpG u bakterií vyvolává aktivaci B-buněk, NK-buněk, monocytů a cytokinů, zatímco u obratlovců motiv CpG nikoli, je to pravděpodobně přinejmenším jeden ze způsobů, jak imunitní systém rozpoznává bakteriální infekci13. ASO obsahující nemetylované motivy CpG (CpsG: cytosin-fosforothioátová vazba - guanin je ještě silnější14) stimulují imunitní systém podobně jako bakteriální DNA a mohly být zodpovědné za některé účinky uváděné z prvních antisense studií.
Chcete-li se vyhnout imunostimulaci, navrhujte ASO, které pokud možno postrádají motivy CpG / CpsG, nebo alespoň ty, které postrádají následující rozšířený motiv, který vyvolává nejsilnější imunitní odpověď14:
- purin-purin-CpG-pyrimidin-pyridmidin
Vzhledem k tomu, že tomu může být obtížné zabránit kvůli komplementární povaze sekvence pro výběr cílového místa, dalším nejlepším krokem je nahradit cytosin v CpG / CpsG 5'.-methylcytosinem (tabulka 2), u kterého bylo prokázáno, že výrazně snižuje imunostimulaci15.
Délka sekvence
Optimální délka je obvykle 12 až 28 bází6. Sekvence kratší než 12 bází zvyšují pravděpodobnost hybridizace mimo cílové místo, zatímco sekvence delší než 25 bází zvyšují pravděpodobnost sníženého vychytávání v buňkách6.
Samokomplementarita
U ASO je třeba zkontrolovat sekundární strukturu a tvorbu dimerů oligonukleotidů, protože jeden z nich může narušit hybridizaci k sekvenci cílového místa. Pokud je to možné, navrhněte ASO tak, aby měl co nejslabší sekundární strukturu a netvořil dimery. Náš kalkulátor sekvencí oligonukleotidů OligoEvaluator™ umožňuje rychlé určení těchto samovolně se tvořících struktur.
Struktury G-čtyřky
ASO obsahující úseky dvou nebo více nukleotidů C nebo G jsou schopny vytvářet neobvyklé struktury, které mohou vyvolat nežádoucí, necílové účinky. Nejběžnější a nejstudovanější jsou úseky bází G, které mohou vést k tvorbě G-kvadrátů16. Bylo prokázáno, že se tato kvarteta vážou na proteiny, včetně transkripčních faktorů17, které mohou napodobovat, a tedy narušovat antisense aktivitu.
Chcete-li se vyhnout tvorbě těchto kvartet, navrhujte ASO, u kterých tyto polyG úseky pokud možno chybí. Opět platí, že vzhledem k tomu, že to nemusí být proveditelné, je dalším nejlepším krokem nahrazení guaninu 7-deaza-dG (tabulka 3), který zablokuje tvorbu kvartetů18.
Funkční motivy
Statistická analýza experimentů PS-ASO zjistila, že následující motivy:
- CCAC
- TCCC
- ACTC
- GCCA<./li>
- CTCT
korelují se zvýšenou účinností antisense, zatímco tyto motivy:
- GGGG
- ACTG
- AAA
- TAA
snižují antisense aktivitu19. Bylo zjištěno, že aktivita RNázy H je nezávislá na sekvenci20; Proto se předpokládá, že posilující motivy vedou ke zvýšené termodynamické stabilitě heteroduplexu mRNA:ASO díky převaze párování bází GC Watson-Crick.
Vazbová afinita
Jak již bylo řečeno, je kriticky důležité určit v cílové mRNA místo, které je bez záhybů, a také zajistit, aby ASO neměl také škodlivou autokomplementaritu. Tato hlediska však sama o sobě k zajištění správné hybridizace nestačí. Různé faktory, například PS, mohou snížit vazebnou afinitu ASO k cílovému místu11, což následně minimalizuje účinnost antisense.
Bylo zjištěno, že modifikace ASO třetí generace jsou nejen odolné vůči nukleázám, ale také zlepšují vazebnou afinitu. Uzamčená nukleová kyselina (Tabulka 4) s omezenou kruhovou strukturou je obzvláště užitečná pro zlepšení vazebné afinity a účinnosti ASO (změna teploty tání na přidání monomeru se pohybuje od +3 do +11 °C ve srovnání s nativní DNA pouze21).
Konstrukce
Abychom získali přehled o sekvencích ASO, uvádíme zde příklady několika antisense léčiv (což je často hlavním cílem výzkumu antisense), která byla schválena nebo jsou v klinických zkouškách. Tato léčiva jsou příkladem (nebo se očekává, že budou v případě těch, která jsou v klinických zkouškách) všech požadovaných výsledků, pokud jde o antisense: dobrý design, dostupný mechanismus podání a účinná modulace. Stejné výsledky jsou rozhodující pro úspěch výzkumných experimentů (naše ASO jsou určeny pro in vitro a in vivo RUO [Research Use Only]).
První generace. V roce 1998 byl prvním schváleným antisense léčivem Fomivirsen (obchodní název Vitravene). Používal se k léčbě cytomegalovirusové retinitidy (CMV) u pacientů s oslabenou imunitou, včetně pacientů s AIDS. Lék byl podáván intravitreální injekcí. 21merový ASO se všemi mezinukleotidovými vazbami PS má následující sekvenci:
- G*C*G*T*T*T*G*C*T*C*T*T*C*T*T*T*T*C*T*T*G*C*G
○ * = PS
a působí tak, že inhibuje translaci transkribované mRNA z CMV genu UL12322. Nakonec byl stažen z trhu, protože rozvoj HAART (vysoce aktivní antiretrovirové terapie) k léčbě HIV snížil počet případů CMV o 75 % a vedl tak ke špatnému prodeji.
Protože ASO obsahující pouze PS nejsou zcela chráněny před nukleázami, mají sníženou hybridizaci s cílovými mRNA, musí se neustále podávat ve velkých množstvích, aby se udržela modulace, a mohou interagovat s proteiny, což může vést k negativním vedlejším účinkům11, byly konstrukty první generace z velké části opuštěny v pipelinech výzkumu a vývoje.
Druhá generace. V roce 2013 se druhým schváleným antisense léčivem stal Mipomersen (obchodní název Kynamro®). Používá se k léčbě familiární hypercholesterolemie, dědičné poruchy. Lék se podává podkožní injekcí. 20merový ASO se všemi PS internukleotidovými vazbami má následující sekvenci:
- G*mC*mC*mU*mC*A*G*T*mC*T*G*mC*T*T*mC*G*mC*A*mC*mC
○ Underline = 2'-O-MOE-RNA (MOE is 2-methoxyethyl)
○ m = methyl, i.e. 5-Me-dC &; 5-Me-U
○ ○ * = PS
a působí tak, že inhibuje translaci mRNA apolipoproteinu B-10023. Existuje riziko závažného poškození jater, takže lék musí být součástí plánu řízení rizik.
Druhá generace antisense molekul, jako je Mipomersen, je navržena s konfigurací 5-10-5 gapmerů24. To je vidět na výše uvedené sekvenci: V tomto případě se jedná o 5' a 3' křídla o 5 bázích (modifikovaná cukernou modifikací odolnou vůči nukleázám / se zvýšenou vazebnou afinitou) a centrální mezeru o 10 standardních deoxyribonukleotidech (bez cukerné modifikace), která umožňuje vazbu RNázy H11.
V tomto konkrétním případě se křídla skládají z 2'-O-MOE-RNA (MOE je 2-methoxyethyl), což je varianta 2'-O-methylové modifikace RNA.
Třetí generace. Od roku 2017 je přípravek Miravirsen (SPC3649) ve fázi II klinických zkoušek25. Testuje se jako léčba hepatitidy C (HCV). Lék se podává podkožní injekcí. Patnáctimerový ASO se všemi mezinukleotidovými vazbami PS má následující sekvenci26:
- C*C*A*T*T*G*T*C*A*C*A*.C*T*C*C
○ Underline = LNA
○ * = PS
a funguje tak, že hybridizuje s lidskou miRNA, miR-122. Tím zabrání miR-122 přivést argonaut do oblasti 5'-UTR HCV RNA, kde se normálně váže, a chrání tak před degradací nukleázou25. Miravirsen proto umožňuje zničení virové RNA.
Přestože Miravirsen není tradiční ASO, protože je zaměřen na miRNA, a proto vede k degradaci mRNA pouze nepřímo, je jedním z nejlepších příkladů konstruktu třetí generace obsahujícího LNA, proto je zde zařazen.
Kontrola cíle
Konečná nemodifikovaná sekvence ASO by měla být podrobena BLAST vyhledávání, aby se zajistilo, že případná off-target hybridizace - nejlépe žádná - nebude interferovat s antisense aktivitou nebo nepovede k nepřijatelné toxicitě.
Úvahy o kvalitě
Pro in vivo. pokusy na zvířatech doporučujeme, aby ASO prošly in-vivo kvalitním čištěním s výměnou solí (nahradí toxické amonné ionty z druhů, které se nacházejí v specifickémnbsp;chemie syntézy fosforamiditů fyziologickými ionty sodíku), testováním endotoxinů (zajišťuje, že přítomnost pyrogenů je nižší než přijatelný limit) a filtrací (snižuje počet kontaminujících CFU pod přijatelný limit). Náš produkt iScale Oligos™ je větší množství materiálu pro projekty in vivo, které lze objednat s tímto čištěním a všemi těmito doplňkovými službami.
Dodávka & Toxicita
Ačkoli to přesahuje rámec tohoto článku, existuje několik vynikajících přehledových článků, které se zabývají různými mechanismy dodávky i potenciální toxicitou11,27,28,29,30.
Závěr
Když jste navrhli ASO, který chcete vyzkoušet v experimentu, jsme připraveni jej pro vás syntetizovat (
).i>naše ASO jsou určeny pro in vitro a in vivo RUO [Research Use Only]). Pokud potřebujete další pomoc, zejména pokud jde o proveditelnost výroby ASO s nestandardními modifikacemi, zašlete prosím žádost na adresu [email protected].
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?