MISSION^® esiRNA Specifikace

Vlastní &; předpřipravené esiRNA

Počínaje koncem října / začátkem listopadu 2020 budou produkty esiRNA, které jsou dodávány ve zkumavkách -. Individual esiRNA, esiOPEN a esiSEC - se začnou dodávat lyofilizované namísto roztoku (produkty esiRNA v destičkách - esiLibrary a esiFLEX - se budou nadále dodávat v roztoku). Tuto změnu oproti produktům ve zkumavkách (většina esiRNA se dodává ve zkumavkách) provádíme z následujících důvodů:

1. Lyofilizované materiály lze dodávat při pokojové teplotě namísto zmrazených na suchém ledu. Toto snížení nákladů na přepravu nám pomůže udržet ceny produktů na co nejnižší úrovni.
2. Odstraněním suchého ledu z přeprav budeme používat méně obalů, což nám zase pomůže splnit závazek naší společnosti snížit dopad na životní prostředí. Stejně jako RNA je esiRNA stabilní při pokojové teplotě po dobu nejméně 3 týdnů. Po obdržení esiRNA ji prosím uložte do -20 °C, dokud nebudete připraveni ji použít. Příloha 2 v Technickém bulletinu produktu obsahuje protokol resuspenze. Bude existovat přechodné období, ve kterém může být část esiRNA stále dodávána v roztoku a zároveň část dodávána v suchém stavu. Co nejrychleji urychlíme přechod na všechny jednotky v suché formě.

Všechny možnosti objednání a cenové nabídky jsou uvedeny v tabulce esiRNA specifikace

MISSION^® esiRNA-powered by Eupheria Biotech - poskytují výzkumníkům RNAi osvědčený, nákladově efektivní a jednoduchý způsob, jak provádět posttranskripční umlčování genů kódujících proteiny a lncRNA (dlouhé nekódující RNA). Biologicky připravené esiRNA se skládají z heterogenního souboru siRNA (přírodní RNA, bez modifikací), které se všechny zaměřují na stejnou sekvenci mRNA. Tyto vícenásobné spouštěče umlčování vedou k vysoce specifickému a účinnému vyřazení genů s nižšími účinky mimo cíl než jednotlivé, chemicky syntetizované siRNA (obrázek 1).

Obrázek 1. Knockdown cílové mRNA lze provést chemicky syntetizovanou siRNA nebo enzymaticky připravenou siRNA (esiRNA). A) Chemicky syntetizovaná siRNA se skládá z jediného umlčovacího spouštěče o délce 21 bp, který je komplementární k cílové mRNA. Vysoká koncentrace siRNA v transfekční reakci vede k výrazným účinkům mimo cíl. B) Naproti tomu esiRNA se skládá z poolu stovek siRNA (21 bp), které pokrývají oblast 300 - 600 bp cílové mRNA. Každá jednotlivá siRNA má v poolu nižší koncentraci, což vede k nižším off-target efektům a zároveň k účinnému knockdownu.

Výhody produktu

• Zaručené umlčení genů
• Menší necílové účinky než u jednotlivých, chemicky syntetizovaných siRNA
• Vysoká specifičnost na cíli z něj dělá účinný primární screeningový nástroj (obrázek 2)
• Dostupný screeningový nástroj RNAi v genomovém měřítku

Obrázek 2. Hodnocení knockdownu genů v HeLa buňkách transfekovaných esiRNA namířenou proti Renilla Luciferase (negativní kontrola) a různým exprimovaným cílům na úrovni mRNA a proteinu. A) Data qPCR ověřují knockdown 24 hodin po transfekci. Množství mRNA bylo u všech transfekcí sníženo o > 90 %. B) Data z kvantitativního Western Blotu potvrzují efektivní knockdown 72 hodin po transfekci. Hladiny proteinů byly sníženy o 45 až 90 %.

Vlastnosti produktu

Následující údaje platí pro všechny možnosti produktu uvedené v tabulce specifikací esiRNA:

• Čištění: Q-Sepharose separace, srážení isopropanolem & promývání etanolem
• Sekvenční forma: IiRNA se sráží pomocí isopropanolu a etanolu:
• Kontrola kvality: Pool stovek siRNA s průměrnou délkou duplexu 21 bp
• Kontrola kvality: V případě, že siRNA není v pořádku, je nutné provést kontrolu kvality: Provádí se ve dvou fázích
  o    produkt PCR klonu cDNA se analyzuje pomocí gelové elektroforézy &; sekvenování DNA
  o    Digestační reakce se analyzuje pomocí gelové elektroforézy
• Stabilita:

  V případě čehokoli označeného níže jako "Dotaz" nebo pokud máte potřeby, které se liší od ostatních uvedených obecných specifikací, zašlete prosím požadavek na sirnarequest@milliporesigma.com.

  Prohlédněte si kompletní seznam předem navržené esiRNA.

*DEQOR je návrhový algoritmus pro esiRNA. Podrobnosti jsou popsány v: Henschel A, Bucholz F & Habermann B (2004). DEQOR: webový nástroj pro návrh a kontrolu kvality siRNA. Nucleic Acids Res, 32, W113-120.

Možnosti produktuesiRNA & Specifikace
Individuální esiRNA	Definice: Individuální, předem navržená esiRNA pro jednotlivé geny kódující proteiny & lncRNA (vyhledávání lncRNA podle přístupového čísla). Všechny esiRNA jsou navrženy na základě anotací z databáze ENSEMBL. Druhy: Lidská & myší Kvantita: 20 & 50 µg Formát: Lyofilizované ve zkumavkách & v TE pufru v 96 / 384jamkových destičkách (na dotaz) v koncentraci 200 ng µl-1
esiLibrary	Definice: Předem navržené knihovny esiRNA pro transkriptom celého genomu & lncRNA. Všechny esiRNA jsou navrženy na základě anotací z databáze ENSEMBL. Druhy: Člověk & amp; myš Kvantita: 1: 1, 2,5 & 5 µg Formát: V TE pufru bez nukleázy v 96 & 384jamkových destičkách v koncentraci 50 ng µl-1 Požádat o cenovou nabídku
esiFLEX	Definice: Vlastní matrice vybrané z celého genomu & kolekce transkriptomů lncRNA. Všechny esiRNA jsou navrženy na základě anotací z databáze ENSEMBL. Druhy: Člověk & amp; myš Kvantita: 1: 1, 2,5 & 5 µg Formát: V TE pufru bez nukleázy v 96 & 384jamkových destičkách v koncentraci 50 ng µl-1 Minimální velikost matice: 1: 24 cílů Požádat o cenovou nabídku
esiOPEN	Definice: Vlastní esiRNA pro jednotlivé geny kódující proteiny & lncRNA. Zadejte cílovou sekvenci 500 bp a esiRNA bude navržena pomocí DEQOR*. Druhy: Any Quantities: 20 & 50 µg Format: Lyofilizované ve zkumavkách Požádat o cenovou nabídku
esiSEC	Definice: Individuální, sekundární & nezávislé esiRNA pro validaci primárních esiRNA zaměřených na jednotlivé geny kódující proteiny & lncRNA. Všechny esiRNA jsou navrženy na základě anotací z databáze ENSEMBL. Druhy: Lidská & myší Kvantita: 20 & 50 µg Formát: Lyofilizované ve zkumavkách Požádat o cenovou nabídku

Kontrola esiRNA

K dispozici je řada pozitivních a negativních kontrol (obrázek 3):

• Pozitivní kontroly: Lidské Eg5 (KIF11) & myší Eg5 (Kif11) esiRNA, stejně jako všechny validované esiRNA (viz tabulka níže), aby byla zajištěna optimalizace transfekce & experimentálního nastavení
• Negativní kontroly: RLUC, FLUC & EGFP (EGFP lze také použít jako pozitivní kontrolu v buňkách exprimujících EGFP) esiRNA k rozlišení sekvenčně specifického umlčení od nespecifických účinků

Obrázek 3. Fenotypová analýza HeLa buněk transfekovaných esiRNA proti A) RLUC (negativní kontrola) a B) Eg5/KIF11 (pozitivní kontrola). RLUC nevyvolává žádné fenotypové změny, zatímco Eg5/KIF11 vyvolává mitotickou zástavu, což se projevuje zakulacenými buňkami.

Validované esiRNA

Mnoho běžných genových cílů bylo validováno pro ≥70% knockdown mRNA (qPCR a Western Blot validační data). Seznam běžně řazených validovaných esiRNA podle symbolu genu naleznete v tabulce. Validované esiRNA jsou vhodné pro optimalizaci transfekce a jako pozitivní kontroly.

Ověřená lidská esiRNA podle symbolu genu
ANAPC1	DCTN2	PLK4
ANAPC10	CETN3	RAD21
ANAPC5	H3F3A	EDC4
AURKB	INCENP	SEC13L1
PPP2R3C/a>	KIF11	SEH1L
CENPA	KIF23	SUV39H2
CEP192	LMNA	TACC3
Podrobněji viz níže.CETN2	MAD2L1	TUBG1
CKAP5	NEK2	NEK2	TUBGCP3
CLASP1	NUMA1	TPX2
CCP110	NUP37

lncRNA esiRNA

Analýzy transkriptomu ukazují, že až 90 % genomu je přepisováno do nekódující RNA, mezi kterou patří mimo jiné i lncRNA. S lncRNA jsou spojeny různé funkce, včetně modifikace chromatinu, koaktivace transkripčních faktorů, transkripce, interakce s proteiny vážícími RNA a represe promotorů. Kromě toho se lncRNA podílejí na vzniku onemocnění, jako je rakovina. Podrobnosti fungování lncRNA je třeba dále objasnit. EsiRNA představují účinný screeningový nástroj pro studium funkce lncRNA (obrázek 4).

Obrázek 4. Data qPCR ověřující knockdown lncRNA v buňkách HeLa 24 hodin po transfekci odpovídající esiRNA. Kontroly byly transfekovány esiRNA proti RLUC a použity pro normalizaci.

Výroba produktu

Biologicky připravená (obrázek 5) esiRNA se vyrábí štěpením dlouhé dsRNA (dvouvláknové RNA) pomocí endoribonukleázy, E. coli RNázy III

Obrázek 5. Přehled výroby esiRNA pro jednotlivé geny. A) DEQOR se používá k výběru cílové oblasti mRNA, která vytvoří největší počet vysoce účinných siRNA, pokryje všechny známé varianty transkriptu a minimalizuje necílové účinky. B) Cílová oblast je extrahována z klonu cDNA a amplifikována pomocí PCR (oba primery jsou použity k zavedení promotorů T7. C) Produkt PCR je přepsán in vitro s využitím RNA polymerázy. D) Žíhaná a dlouhá dvouvláknová RNA (dsRNA) se štěpí RNázou III a purifikací se odstraní DNA templát, zbytky NTP a neúplně natrávená dsRNA. Nakonec je esiRNA připravena jako pool stovek siRNA s průměrnou délkou duplexu 21 bp.

esiRNA záruka

MISSION^® esiRNA sníží hladiny cílové mRNA o 70 %, v kultivovaných buňkách, při transfekci v koncentraci ≥30 nM. Pokud esiRNA nesníží cílový gen o 70 %, poskytneme pro daný gen další esiRNA zdarma. Pokud další esiRNA pro daný gen nemáme, vrátíme vám kupní cenu.

Pro poskytnutí záruky je nutné obdržet příslušné podpůrné údaje o účinnosti transfekce. Vhodná podpůrná data pro účinnost transfekce by zahrnovala data qPCR porovnávající hladiny cílové mRNA validované esiRNA MISSION^® transfekované v koncentraci ≥ 30 nM s vhodnou negativní kontrolou (jako je mock transfekce, RLUC, FLUC nebo eGFP esiRNA), která prokazuje knockdown cílové mRNA ve výši 70 %.

Vzhledem k variabilitě protilátek a poločasů rozpadu proteinů nemůžeme akceptovat údaje z metod detekce založených na proteinech.

Často kladené otázky

Chcete-li se o esiRNA dozvědět více, navštivte naši Často kladené otázky sekce.

Video tutoriál

Naučte se o screeningu v savčích buňkách pomocí esiRNA.

Pokud potřebujete další pomoc, obraťte se na naši skupinu technických služeb na sirnarequest@sial.com.

Dozvědět se více o RNA interferenci: od studií jednotlivých genů po celogenomové screeny - Dr. Julia Krüger Senior Scientist ve společnosti Eupheria Biotech GmbH

Výběr citací

Jednogenová esiRNA

1. Vania L, Rebelo TM, Ferreira E, Weiss SFT. 2018. Knock-down of LRP/LR promotes apoptosis in early and late stage colorectal carcinoma cells via caspase activation. BMC Cancer. 18(1): https://doi.org/10.1186/s12885-018-4531-2

2. Ali MM, Akhade VS, Kosalai ST, Subhash S, Statello L, Meryet-Figuiere M, Abrahamsson J, Mondal T, Kanduri C. 2018. PAN-cancer analysis of S-phase enriched lncRNAs identifies oncogenic drivers and biomarkers. Nat Commun. 9(1): https://doi.org/10.1038/s41467-018-03265-1

3. Birth P, Schöne S, Stelzl U, Meijsing SH. Identification and characterization of BATF3 as a context-specific coactivator of the glucocorticoid receptor. PLoS ONE. 12(7):e0181219. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181219

4. Natale F, Rapp A, Yu W, Maiser A, Harz H, Scholl A, Grulich S, Anton T, Hörl D, Chen W, et al. 2017. Identification of the elementary structural units of the DNA damage response. Nat Commun. 8(1): https://doi.org/10.1038/ncomms15760

5. Kim J, Hu Z, Cai L, Li K, Choi E, Faubert B, Bezwada D, Rodriguez-Canales J, Villalobos P, Lin Y, et al. 2017. CPS1 maintains pyrimidine pools and DNA synthesis in KRAS/LKB1-mutant lung cancer cells. Nature. 546(7656):168-172. https://doi.org/10.1038/nature22359

6. Terkawi MA, Takano R, Furukawa A, Murakoshi F, Kato K. 2017. Involvement of ?-defensin 130 (DEFB130) in the macrophage microbicidal mechanisms for killing Plasmodium falciparum. Sci Rep. 7(1): https://doi.org/10.1038/srep41772

7. Ganesan S, Alex AA, Chendamarai E, Balasundaram N, Palani HK, David S, Kulkarni U, Aiyaz M, Mugasimangalam R, Korula A, et al. 2016. Rationale and efficacy of proteasome inhibitor combined with arsenic trioxide in the treatment of acute promyelocytic leukemia. Leukemia. 30(11):2169-2178. https://doi.org/10.1038/leu.2016.227

8. Prieto J, León M, Ponsoda X, García-García F, Bort R, Serna E, Barneo-Muñoz M, Palau F, Dopazo J, López-García C, et al. 2016. Dysfunctional mitochondrial fission impairs cell reprogramming. Cell Cycle. 15(23):3240-3250. https://doi.org/10.1080/15384101.2016.1241930

9. Kim J, Tan Y, Wang X, Cao X, Veeraraghavan J, Liang Y, Edwards DP, Huang S, Pan X, Li K, et al. 2016. Comprehensive functional analysis of the tousled-like kinase 2 frequently amplified in aggressive luminal breast cancers. Nat Commun. 7(1): https://doi.org/10.1038/ncomms12991

10. Telorac J, Prykhozhij SV, Schöne S, Meierhofer D, Sauer S, Thomas-Chollier M, Meijsing SH. 2016. Identification and characterization of DNA sequences that prevent glucocorticoid receptor binding to nearby response elements. Nucleic Acids Res. 44(13):6142-6156. https://doi.org/10.1093/nar/gkw203

11. Gjaltema RAF, van der Stoel MM, Boersema M, Bank RA. 2016. Disentangling mechanisms involved in collagen pyridinoline cross-linking: The immunophilin FKBP65 is critical for dimerization of lysyl hydroxylase 2. Proc Natl Acad Sci USA. 113(26):7142-7147. https://doi.org/10.1073/pnas.1600074113

12. Khumalo T, Ferreira E, Jovanovic K, Veale RB, Weiss SFT. Knockdown of LRP/LR Induces Apoptosis in Breast and Oesophageal Cancer Cells. PLoS ONE. 10(10):e0139584. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139584

13. Chauhan L, Jenkins GD, Bhise N, Feldberg T, Mitra-Ghosh T, Fridley BL, Lamba JK. 2015. Genome-wide association analysis identified splicing single nucleotide polymorphism in CFLAR predictive of triptolide chemo-sensitivity. BMC Genomics. 16(1): https://doi.org/10.1186/s12864-015-1614-1

14. Suhail TV, Singh P, Manna TK. 2015. Suppression of centrosome protein TACC3 induces G1 arrest and cell death through activation of p38?p53?p21 stress signaling pathway. European Journal of Cell Biology. 94(2):90-100. https://doi.org/10.1016/j.ejcb.2014.12.001

15. Finetti F, Patrussi L, Masi G, Onnis A, Galgano D, Lucherini OM, Pazour GJ, Baldari CT. 2014. Specific recycling receptors are targeted to the immune synapse by the intraflagellar transport system. Journal of Cell Science. 127(9):1924-1937. https://doi.org/10.1242/jcs.139337

16. Chu X, Chen W, Li N, Hu X, Du C, Yu S, Zhou M, Zhang X, Jiang G, Han W, et al. 2014. Cytosolic Double-Stranded DNA Induces Nonnecroptotic Programmed Cell Death in Trophoblasts via IFI16. 210(9):1476-1486. https://doi.org/10.1093/infdis/jiu272

17. Basu N, Saha S, Khan I, Ramachandra SG, Visweswariah SS. 2014. Intestinal Cell Proliferation and Senescence Are Regulated by Receptor Guanylyl Cyclase C and p21. Journal of Biological Chemistry. 289(1):581-593. https://doi.org/10.1074/jbc.m113.511311

18. Ahmed S, Maratha A, Butt AQ, Shevlin E, Miggin SM. 2013. TRIF-Mediated TLR3 and TLR4 Signaling Is Negatively Regulated by ADAM15. J.I.. 190(5):2217-2228. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1201630

19. Ngondo-Mbongo RP, Myslinski E, Aster JC, Carbon P. 2013. Modulation of gene expression via overlapping binding sites exerted by ZNF143, Notch1 and THAP11. 41(7):4000-4014. https://doi.org/10.1093/nar/gkt088

20. Vella P, Scelfo A, Jammula S, Chiacchiera F, Williams K, Cuomo A, Roberto A, Christensen J, Bonaldi T, Helin K, et al. 2013. Tet Proteins Connect the O-Linked N-acetylglucosamine Transferase Ogt to Chromatin in Embryonic Stem Cells. Molecular Cell. 49(4):645-656. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2012.12.019

21. Al-Salihi MA, Herhaus L, Macartney T, Sapkota GP. 2012. USP11 augments TGF? signalling by deubiquitylating ALK5. Open Biol.. 2(6):120063. https://doi.org/10.1098/rsob.120063

22. Arnandis T, Ferrer-Vicens I, García-Trevijano ER, Miralles VJ, García C, Torres L, Viña JR, Zaragozá R. 2012. Calpains mediate epithelial-cell death during mammary gland involution: mitochondria and lysosomal destabilization. Cell Death Differ. 19(9):1536-1548. https://doi.org/10.1038/cdd.2012.46

23. Lin ZP, Lee Y, Lin F, Belcourt MF, Li P, Cory JG, Glazer PM, Sartorelli AC. 2011. Reduced Level of Ribonucleotide Reductase R2 Subunits Increases Dependence on Homologous Recombination Repair of Cisplatin-Induced DNA Damage. Mol Pharmacol. 80(6):1000-1012. https://doi.org/10.1124/mol.111.074708

Screeny celého genomu a dílčích knihoven

1. Toyoda Y, Cattin CJ, Stewart MP, Poser I, Theis M, Kurzchalia TV, Buchholz F, Hyman AA, Müller DJ. 2017. Genome-scale single-cell mechanical phenotyping reveals disease-related genes involved in mitotic rounding. Nat Commun. 8(1): https://doi.org/10.1038/s41467-017-01147-6

2. López-Saavedra A, Gómez-Cabello D, Domínguez-Sánchez MS, Mejías-Navarro F, Fernández-Ávila MJ, Dinant C, Martínez-Macías MI, Bartek J, Huertas P. 2016. A genome-wide screening uncovers the role of CCAR2 as an antagonist of DNA end resection. Nat Commun. 7(1): https://doi.org/10.1038/ncomms12364

3. Ding L, Paszkowski-Rogacz M, Winzi M, Chakraborty D, Theis M, Singh S, Ciotta G, Poser I, Roguev A, Chu W, et al. 2015. Systems Analyses Reveal Shared and Diverse Attributes of Oct4 Regulation in Pluripotent Cells. Cell Systems. 1(2):141-151. https://doi.org/10.1016/j.cels.2015.08.002

lncRNA esiRNA

1. Winzi M, Casas Vila N, Paszkowski-Rogacz M, Ding L, Noack S, Theis M, Butter F, Buchholz F. The long noncoding RNA lncR492 inhibits neural differentiation of murine embryonic stem cells. PLoS ONE. 13(1):e0191682. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191682

2. Laneve P, Po A, Favia A, Legnini I, Alfano V, Rea J, Carlo VD, Bevilacqua V, Miele E, Mastronuzzi A, et al. 2017. The long noncoding RNA linc-NeD125 controls the expression of medulloblastoma driver genes by microRNA sponge activity. Oncotarget. 8(19):31003-31015. https://doi.org/10.18632/oncotarget.16049

3. Bevilacqua V, Gioia U, Di Carlo V, Tortorelli AF, Colombo T, Bozzoni I, Laneve P, Caffarelli E. 2015. Identification of linc-NeD125, a novel long non coding RNA that hosts miR-125b-1 and negatively controls proliferation of human neuroblastoma cells. RNA Biology. 12(12):1323-1337. https://doi.org/10.1080/15476286.2015.1096488

4. Theis M, Paszkowski-Rogacz M, Weisswange I, Chakraborty D, Buchholz F. 2015. Targeting Human Long Noncoding Transcripts by Endoribonuclease-Prepared siRNAs. J Biomol Screen. 20(8):1018-1026. https://doi.org/10.1177/1087057115583448

5. Chakraborty D, Kappei D, Theis M, Nitzsche A, Ding L, Paszkowski-Rogacz M, Surendranath V, Berger N, Schulz H, Saar K, et al. 2012. Combined RNAi and localization for functionally dissecting long noncoding RNAs. Nat Methods. 9(4):360-362. https://doi.org/10.1038/nmeth.1894