Protokoly diferenciace indukovaných pluripotentních kmenových buněk

Přečtěte si o tom

• Co jsou indukované pluripotentní kmenové buňky?
• sbírka iPSC
• Často kladené otázky o iPSC
/a>
• Související produkty
• Reference

Co jsou indukované pluripotentní kmenové buňky?

Dospělé somatické buňky lze přeprogramovat na indukované pluripotentní kmenové buňky (iPSC) s nadměrnou expresí klíčových reprogramovacích genů (OCT4, KLF4, SOX2, cMYC, NANOG a LIN28). Lidské iPSC mají jedinečnou schopnost diferencovat se na jakýkoli typ buněk těla, včetně:

• Ektodermálních: neuronů, astrocytů, oligodendrocytů, buněk epitelu sítnice (RPE), epidermálních, vlasových a keratinocytů.
• Endodermální: Hepatocyt, β-isletová buňka pankreatu, střevní epitelová buňka, plicní alveolární buňky.
• Mezodermální: Krvetvorné buňky, Endotelové buňky, Kardiomyocyty, Buňky hladkého svalstva, Buňky kosterního svalstva, Buňky ledvin, Adipocyty, Chondrocyty a Osteocyty.

Obrázek 1. Cesta iPSC

iPSC Collection

Nabízíme rozsáhlou kolekci médií pro buněčné kultury, doplňků, bioaktivních malých molekul a růstových faktorů používaných k řízení osudu lidských iPSC. Následující tabulka upozorňuje na nejpoužívanější protokoly, média a charakterizační protilátky používané k diferenciaci lidských iPSC do různých buněčných linií.

Diferencovaný typ buňky	Média a doplňky	.Charakterizační protilátky	Reference
Neurální kmenové buňky	DMEM/F12, Glutamin, Neurobasal Media, N2, B27, SB431542, CHIR99021, Sloučenina E, Human LIF, Noggin, bFGF, EGF Objednat kompletní média	Nestin, PAX6, OTX2	Vysoce účinná neurální konverze lidských ES a iPS buněk pomocí duální inhibice signalizace SMAD1
Kortikální neuron	.DMEM/F12, Glutamin, Neurobasal Media, N2, B27, SB431542, CHIR99021, Sloučenina E./a>, Noggin, bFGF, EGF Objednat kompletní média	MAP2, TBR1, CTIP2, VGLUT1	Řízená diferenciace lidských pluripotentních kmenových buněk na neurony mozkové kůry a neuronální sítě2
Dopaminergní neuron	DMEM/F12, Glutamin,<./a> Neurobasal Media, N2, B27, SB431542, CHIR99021, CHIR99021nbsp;Sloučenina E, Lidský LIF, SHH, FGF8, BDNF, GDNF, TGFβ3, cAMP Objednat kompletní média	TH, TUJ-1, LMX1A, FOXA2, nbsp;NURR1	Řízená diferenciace dopaminových neuronů z lidských pluripotentních kmenových buněk3
Motorické neurony	DMEM/F12, Glutamin, Neurobasal Media, N2, B27, SB431542, CHIR99021, Sloučenina E,  a href="/CZ/cs/product/MM/565790">Sloučenina E, nbsp;all-trans retinová kyselina (ATRA), SHH, BDNF, BDNF, BDNFCNTF, GDNF	Nestin, TUJ-1, ChAT, Islet1, Hb9, Hoxa2	Řízenou diferenciací lidských indukovaných pluripotentních kmenových buněk vznikají aktivní motorické neurony	Příbuzné kmenové buňky, které jsou určeny k diferenciaci, jsou určeny k diferenciaci.sup>4
Astrocyt	DMEM/F12, Glutamin, B27, neesenciální aminokyseliny, Penicilin-Streptomycin, FBS, bFGF, CNTF, BFGF, BFGFBMP4, Aktivin A, Heregulin 1β, IGF-1	GFAP, TUJ-1, CD44	Účinné generování astrocytů z lidských pluripotentních kmenových buněk za definovaných podmínek5
Oligodendrocyty	DMEM/F12, Glutamin, Neurobasal Media, N2, B27, SB431542, CHIR99021, Sloučenina E./a>, Human LIF, all-trans retinová kyselina (ATRA), SHH, SAG, PDGF, PDGF, nbsp;IGF-I, NT3, Insulin, T3, cAMP	PAX6, OLIG2, NKX2.2, O4, SOX10, MBP, MAP2	Efektivní generace myelinizačních oligodendrocytů od pacientů s primární progresivní roztroušenou sklerózou pomocí indukovaných pluripotentních kmenových buněk
Kardiomyocyty	RPMI 1640, B27, rH-albumin, L-askorbová kyselina 2-fosfátová./a>, Laktát, CHIR99021, Wnt-C59	TNNT2, α-SMA, α-Actinin, vWF, MLC2A, MLC2V	Chemicky definovaná generace lidských kardiomyocytů7.
Kosterní sval	IMDM, FBS, Glutamin, Penicilin-Streptomycin, neesenciální aminokyseliny, 2-merkaptoethanol, kyselina olejová, kyselina linolová, síran železnatý, glukonát železitý sodný, koní sérum, sérum z koníY-27632, bFGF	CD13, nbsp;CD31, CD56, CD44, CD45, CD49b, CD146, MyHC	Efektivní derivace a indukovatelná diferenciace expanzivních kosterních myogenních buněk z lidských ES a iPS buněk specifických pro pacienty8
Cévní endotelová/hladká svalovina	DMEM/F12, Glutamin, Neurobasal Media, N2, B27, CHIR99021, BIO, Y-27632, BMP4, VEGF, Forskolin, PDGF-BB, Aktivin A, Heparin	CD31, CD144, vWF, I-CAM1, SMA, MyHC, VECAD, PECAM	Generace cévních endoteliálních a hladkých svalových buněk z lidských pluripotentních kmenových buněk9
Hepatocyty	RPMI 1640, B27, Aktivin A, Aktivin Anbsp;BMP4, bFGF, HGF, Oncostatin M	FOXA2, SOX17, GATA4, HNF4-α, AFP, ALB	Vysoce účinná tvorba lidských buněk podobných hepatocytům z indukovaných pluripotentních kmenových buněk10
Buňky β slinivky břišní	DMEM/F12, IMDM, hovězí sérový albumin, N2, B27, ITS, BMP4, Aktivin A, BMP4, Aktivin AFGF7, Noggin, bFGF, nbsp;EGF, nikotinamid, Exendin-4, all-trans retinová kyselina (ATRA)	PDX1, FOXA2, SOX9, HNF1β, c-peptid, inzulín, somatostatin	Vysoce účinná diferenciace lidských ES buněk a iPS buněk na zralé pankreatické buňky produkující inzulín11
Plicní
buňky./td>	DMEM/F12, Glutamin, B27, N2, použití pro výrobu a distribuci potravin a nápojů, např.kyselina askorbová, monothioglycerol, hovězí sérový albumin, penicilin-streptomycin, Y-27632, Y-27632nbsp;Dorsomorphin, SB431542, IWP2, CHIR99021, BMP4, bFGF, Aktivin A, FGF-10, FGF7,  EGF, all-trans retinová kyselina (ATRA)	FOXA2, SOX2, NKX2.1, p63	Efektivní generace epiteliálních buněk plic a dýchacích cest z lidských pluripotentních kmenových buněk12

Často kladené otázky o iPSC

1. Jaké jsou problémy s diferenciací kmenových buněk, zejména pokud jde o iPSC?

• Efektivita a reprodukovatelnost: Navzdory pokrokům může být usměrňování iPSC k diferenciaci na specifické buněčné typy stále nekonzistentní. Zlepšení konzistence a spolehlivosti diferenciačních protokolů má zásadní význam pro jejich širší využití ve výzkumu a klinických podmínkách. Kromě toho mohou různé linie iPSC vykazovat různou účinnost při diferenciaci do specifických zárodečných vrstev, přičemž některé linie iPSC vykazují zvýšenou diferenciaci směrem k mezodermu ve srovnání s endodermem a naopak.
• Heterogenita diferencovaných buněčných populací: I úspěšná diferenciace často vede k heterogenním buněčným populacím s různou zralostí, funkčností a čistotou. Kontrola a minimalizace této heterogenity je nezbytná pro získání jednotných a funkčních buněčných populací pro následné aplikace.
• Zralost a funkčnost: Dosažení zralých a funkčních buněk odvozených z iPSC je náročné. Mnoho typů buněk může vykazovat nezralé fenotypy nebo funkční nedostatky ve srovnání s nativními protějšky, takže zlepšení diferenciačních protokolů je zásadní pro zlepšení klinické translace.
• Šíření a automatizace: Pro výrobu velkého množství konzistentních a vysoce kvalitních buněčných produktů pro klinické aplikace jsou zapotřebí škálovatelné a automatizované diferenciační platformy. Vývoj robustních výrobních procesů, které splňují regulační normy, je pro komercializaci klíčový.

2. Jak mohou vědci zlepšit výsledky diferenciace kmenových buněk?

• Optimalizujte podmínky kultivace: Přesné vyladění složení kultivačního média, včetně růstových faktorů, cytokinů, malých molekul a doplňků, může významně ovlivnit účinnost a specifičnost diferenciace kmenových buněk. Iterativní optimalizace kultivačních podmínek založená na systematickém experimentování a zpětné vazbě je nezbytná pro dosažení reprodukovatelných a robustních výsledků diferenciace.
• Používejte definovaná a chemicky definovaná média: Přechod od složitých a nedefinovaných kultivačních systémů k definovaným a chemicky definovaným složením médií snižuje variabilitu a zvyšuje kontrolu nad diferenciačními procesy. Definované formulace médií obsahují pouze dobře charakterizované složky, což usnadňuje standardizaci, škálovatelnost a dodržování předpisů, zejména pro klinické aplikace.
• Využívejte biomimetické kultivační systémy: Napodobování fyziologického mikroprostředí buněk pomocí biomimetických kultivačních systémů, jako jsou 3D scaffoldy, platformy organ-on-a-chip a systémy pro společné kultivace, zvyšuje relevanci a věrnost in vitro diferenciačních modelů. Tyto systémy poskytují prostorové podněty, interakce mezi buňkami a mechanické podněty, které lépe napodobují architekturu a funkci tkání, a podporují tak fyziologicky relevantnější výsledky diferenciace.

Můžete také integrovat přístupy založené na multi-omice, využívat analýzu jednotlivých buněk, používat editaci genomu pro přesnou kontrolu a implementovat strojové učení a integraci dat pro zlepšení výsledků diferenciace. 

3. Jakých největších chyb se podle vás dopouštějí výzkumní pracovníci při iprotokolech diferenciace PSK?

Přestože vědci stále dosahují významného pokroku v protokolech diferenciace kmenových buněk, úspěchu a reprodukovatelnosti jejich experimentů může bránit několik běžných chyb, jako například:

• Nedostatečná optimalizace: Nedůkladná optimalizace diferenciačních protokolů pro konkrétní typy buněk a experimentální podmínky může vést k proměnlivým nebo nekonzistentním výsledkům. Výzkumníci mohou přehlížet význam systematického testování různých kultivačních podmínek, včetně růstových faktorů, cytokinů, vlastností substrátu a délky kultivace, pro určení optimálních podmínek pro robustní a reprodukovatelnou diferenciaci.
• Neadekvátní charakterizace: Nedostatečná charakterizace diferencovaných buněčných populací může zastřít heterogenitu, zralost a funkčnost produkovaných buněk. Výzkumníci mohou přehlížet potřebu komplexních fenotypových a funkčních analýz, včetně imunoznačení, průtokové cytometrie, profilování genové exprese a funkčních testů, aby ověřili identitu a kvalitu diferencovaných buněk.
• Nedostatečné řešení heterogenity: Ignorování nebo nedostatečné řešení heterogenity v rámci diferencovaných buněčných populací může ohrozit spolehlivost a interpretovatelnost experimentálních výsledků. Výzkumníci mohou přehlížet význam čištění nebo obohacování specifických buněčných podskupin, například pomocí fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (FACS) nebo magnetického třídění buněk, aby získali homogenní buněčné populace pro následné analýzy nebo aplikace.
• Slabá reprodukovatelnost: Zanedbání dokumentace a standardizace experimentálních postupů, přípravy činidel a protokolů pro manipulaci s buňkami může zhoršit reprodukovatelnost v různých laboratořích nebo experimentech. Výzkumní pracovníci mohou přehlížet význam vedení podrobných záznamů, dodržování standardizovaných pracovních postupů a sdílení protokolů a činidel s vědeckou komunitou pro usnadnění reprodukovatelnosti a transparentnosti.
• Zanedbání opatření pro kontrolu kvality: Podcenění významu opatření pro kontrolu kvality, jako je sledování životaschopnosti, čistoty a sterility buněk v průběhu celého procesu diferenciace, může vést k experimentálním artefaktům nebo problémům s kontaminací. Výzkumníci mohou přehlížet potřebu pravidelného ověřování pravosti buněčných linií, testování mykoplazmy a screeningu endotoxinů, aby byla zajištěna integrita a bezpečnost buněčných kultur.
• Přílišné spoléhání na 2D kultivační systémy: Spoléhání se pouze na tradiční 2D kultivační systémy bez zohlednění omezení těchto platforem při rekapitulaci komplexní tkáňové architektury a mikroprostředí může přinést suboptimální výsledky diferenciace. Výzkumníci mohou přehlížet výhody využití 3D kultivačních systémů, organoidních modelů nebo mikrofluidních zařízení, které lépe napodobují in vivo fyziologii tkání a zvyšují účinnost a funkčnost diferenciace.
• Nedostatečná analýza a interpretace dat: Nedostatečná analýza a interpretace dat může vést k nesprávné interpretaci nebo přílišnému zjednodušení komplexních experimentálních výsledků. Výzkumní pracovníci mohou přehlížet význam použití vhodných statistických metod, technik vizualizace dat a výpočetních nástrojů pro analýzu souborů dat s vysokou dimenzí a získání smysluplných poznatků ze svých experimentů.

4. Jak může technologie pomoci s protokoly a výsledky diferenciace kmenových buněk?

Technologie hraje klíčovou roli při vývoji protokolů diferenciace kmenových buněk a zlepšování výsledků těchto experimentů několika způsoby:

1. Vysokokapacitní screening (HTS): Automatizované platformy vybavené roboty, systémy pro manipulaci s kapalinami a zobrazovacími zařízeními umožňují vysoce výkonný screening velkých knihoven sloučenin nebo kultivačních podmínek s cílem identifikovat faktory, které podporují nebo inhibují diferenciaci kmenových buněk. HTS urychluje objevování nových malých molekul, růstových faktorů nebo formulací kultivačních médií, které zvyšují účinnost a specifičnost diferenciace.
2. Omics Technologies: Pokroky v genomice, transkriptomice, proteomice a metabolomice umožňují komplexní profilování kmenových buněk a jejich diferencovaných potomků na molekulární úrovni. Integrace multi-omických dat poskytuje vhled do regulačních sítí, signálních drah a klíčových biomarkerů spojených s různými fázemi diferenciace, což vede k optimalizaci diferenciačních protokolů a identifikaci nových cílů pro modulaci rozhodování o osudu buněk.
3. Nástroje pro úpravu genomu: Přesné technologie editace genomu, jako je CRISPR-Cas9, umožňují cílenou manipulaci s genovou expresí, epigenetickými modifikacemi a signálními drahami zapojenými do diferenciace kmenových buněk. Editace genomu umožňuje výzkumníkům vytvářet kmenové buňky s požadovanými fenotypovými vlastnostmi, zvyšovat účinnost diferenciace a modelovat genetická onemocnění in vitro, což usnadňuje studium mechanismů onemocnění a vývoj personalizovaných terapií.

Odkazy

1. Chambers SM, Fasano CA, Papapetrou EP, Tomishima M, Sadelain M, Studer L. 2009. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27(3):275-280. https://doi.org/10.1038/nbt.1529

2. Shi Y, Kirwan P, Livesey FJ. 2012. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7(10):1836-1846. https://doi.org/10.1038/nprot.2012.116

3. Ma L, Liu Y, Zhang S. 2011. Directed Differentiation of Dopamine Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.411-418. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-201-4_30

4. Karumbayaram S, Novitch BG, Patterson M, Umbach JA, Richter L, Lindgren A, Conway AE, Clark AT, Goldman SA, Plath K, et al. 2009. Directed Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells Generates Active Motor Neurons. 27(4):806-811. https://doi.org/10.1002/stem.31

5. Shaltouki A, Peng J, Liu Q, Rao MS, Zeng X. 2013. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. 31(5):941-952. https://doi.org/10.1002/stem.1334

6. Douvaras P, Wang J, Zimmer M, Hanchuk S, O’Bara M, Sadiq S, Sim F, Goldman J, Fossati V. 2014. Efficient Generation of Myelinating Oligodendrocytes from Primary Progressive Multiple Sclerosis Patients by Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 3(2):250-259. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2014.06.012

7. Burridge PW, Matsa E, Shukla P, Lin ZC, Churko JM, Ebert AD, Lan F, Diecke S, Huber B, Mordwinkin NM, et al. 2014. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11(8):855-860. https://doi.org/10.1038/nmeth.2999

8. Maffioletti SM, Gerli MFM, Ragazzi M, Dastidar S, Benedetti S, Loperfido M, VandenDriessche T, Chuah MK, Tedesco FS. 2015. Efficient derivation and inducible differentiation of expandable skeletal myogenic cells from human ES and patient-specific iPS cells. Nat Protoc. 10(7):941-958. https://doi.org/10.1038/nprot.2015.057

9. Patsch C, Challet-Meylan L, Thoma EC, Urich E, Heckel T, O’Sullivan JF, Grainger SJ, Kapp FG, Sun L, Christensen K, et al. 2015. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 17(8):994-1003. https://doi.org/10.1038/ncb3205

10. Si-Tayeb K, Noto FK, Nagaoka M, Li J, Battle MA, Duris C, North PE, Dalton S, Duncan SA. 2010. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51(1):297-305. https://doi.org/10.1002/hep.23354

11. Zhang D, Jiang W, Liu M, Sui X, Yin X, Chen S, Shi Y, Deng H. 2009. Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19(4):429-438. https://doi.org/10.1038/cr.2009.28

12. Huang SXL, Islam MN, O'Neill J, Hu Z, Yang Y, Chen Y, Mumau M, Green MD, Vunjak-Novakovic G, Bhattacharya J, et al. 2014. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32(1):84-91. https://doi.org/10.1038/nbt.2754