Odvození funkčních oligodendrocytárních progenitorových buněk (OPC) z linií lidských neurálních kmenových buněk

Christine Chen, Michael Moeller, Anna Abai, Nick Asbrock and Vi Chu

Merck, Bioscience Division, Temecula, CA, USA

Lidské nervové kmenové buňky (hNSC) jsou intenzivně studovány pro svůj terapeutický potenciál u neurodegenerativních onemocnění a poranění páteře. V závislosti na mikroprostředí a růstových podnětech mohou tyto buňky podléhat neurogenezi a nahrazovat poškozené buňky. V centrálním nervovém systému samotná neurogeneze k nápravě poškození neuronů nestačí. Funkční neurony musí být chráněny myelinovou pochvou, kterou syntetizují oligodendrocyty, aby mohly úspěšně přenášet akční potenciál na dlouhé vzdálenosti. Pochopení vývoje oligodendrocytů je nezbytným milníkem pro vývoj klinické a farmaceutické léčby neurodegenerativních patologií, jako je roztroušená skleróza.

Obecně hNSC vytvářejí nízký a nekonzistentní počet oligodendrocytů in vitro. Za účelem vývoje modelového systému pro kultivované oligodendrocyty byly testovány tři linie nervových kmenových buněk z hlediska jejich schopnosti diferencovat se v oligodendrocytární progenitorové buňky (OPC). Dvě z buněčných linií reagovaly na diferenciační režim, který zahrnoval malé molekuly a růstové faktory, PDGF, NT3, hormon štítné žlázy (T3) a FGF2. Obě buněčné linie vykazovaly 30 až 50% nárůst populace OPC měřený pomocí imunofluorescenčního barvení na několik oligodendrogliálních markerů: NG2, O4, Sox10 a GalC. Tyto OPC se mohly dále diferencovat na zralé oligodendrocyty za podmínek bez mitogenů. Naše údaje ukazují, že tyto buňky si zachovaly stabilní vlastnosti OPC po dobu nejméně tří pasáží a při diferenciaci exprimovaly více oligodendrocytárních markerů. Pomocí systému společné kultivace jsme ukázali, že se tyto lidské OPC vyvinuly ve zralé oligodendrocyty, které produkovaly MBP kolem axonu v primárních kulturách potkaních neuronů.

Metody

Kultura lidských neuronálních kmenových buněk

Byly použity dvě linie lidských imortalizovaných neurálních kmenových buněk, ReNcell™ VM (SCC008) a ReNcell™ CX (SCC007), spolu s linií lidských neurálních progenitorových buněk odvozených od ESC ENStem-A™ (SCR055). Neurální kmenové buňky byly kultivovány jako monovrstvy s použitím udržovacího média ReNcell (SCM005) čerstvě doplněného 20 ng/ml FGF-2 nebo expanzního média ENStem™-A (SCM004) čerstvě doplněného 20 ng/ml FGF-2 a 2 mM glutaminu. Linie ReNcell byly kultivovány na baňkách potažených 20 μg/ml lamininu (L2020), zatímco buňky hESC-NPC byly kultivovány na baňkách potažených Matrigelem. Všechny buňky byly udržovány v inkubátoru pro tkáňové kultury s 5 % CO₂, 37 °C, enzymaticky pasážovány pomocí roztoku Accutase^® (A6964) a nasazovány v hustotě 1X10⁵/cm², dokud nedosáhly 70-80% konfluence.

Diferenciace a zrání oligodendrocytů

Lidské nervové kmenové buňky byly sklizeny a resuspendovány v příslušných růstových médiích v množství 5 x 10⁵ buněk/ml na destičkách s ultra nízkou adhezí (CLS3471), aby se vytvořily neurosféry. Neurosféry byly ošetřeny kyselinou retinovou (R2625) předtím, než byly přepnuty do média pro obohacení oligodendrocytů (OEM: DMEM/F12 s 1X NEAA, 2 mM glutamin, doplněk média N21, koktejl růstových faktorů (hormon štítné žlázy (T3, T5516); rekombinantní lidský PDGF-AA (SRP3268), rekombinantní lidský neurotrofin-3 (N1905) a rekombinantní lidský základní FGF2 (F0291). Neurosféry byly dále kultivovány v OEM po několik pasáží, než byly naneseny na baňku potaženou Matrigelem pro expanzi v expanzním médiu pro OPC (SCM107). Hustota výsevu obohacených kultur OPC byla 1-2 x 10⁴ buněk/cm².

Charakterizace progenitorových buněk oligodendrocytů

10⁴ buněk/cm² OPC bylo naneseno na 0.1% poly-L-ornitinu (P4957) a 10 μg/ml lamininu (L2020) potažené Millicell^® EZ SLIDES (PEZGS0416) nebo baňkách T25 a kultivovány přes noc před přechodem na médium bez růstových faktorů. Oligodendrocyty se nechaly dozrát po dobu 2 až 3 týdnů, než byly fixovány 2% paraformaldehydem nebo lyzovány pro extrakci RNA.

Proliferující OPC byly charakterizovány pomocí protilátek specifických pro markery časných oligodendrocytů, včetně anti-Sox10 (AB5727, 1:200), anti-NG2 (AB5320, 1:200), anti-Olig-2 (AB9610, 1:100) a anti-O4 (MAB345, 1:50), zatímco dvoutýdenní diferencované oligodendrocyty byly charakterizovány pomocí protilátek proti středním až pozdním oligodendrocytárním markerům, včetně anti-GalC (MAB342, 1:200), anti-PLP-1/DM20 (MAB388, 1:100), anti-MBP (05-675, 1:25), anti-MOG (MAB5680, 1:25), anti-CNPase (1:100) a anti-RIP (1:25). Astrocyty byly označeny anti-GFAP (MAB3402, 1:250) a neurony byly označeny anti-bIII tubulinem (MAB1637, 1:100) nebo anti-MAP2 (MAB3418, 1:200).

In Vitro Myelinizační test

12mm krycí skla byla přes noc ošetřena kyselinou 1N HCl (H1758), opláchnuta Milli-Q^® H₂O (MILLIQ) a poté sterilizována autoklávováním. Krycí skla byla před potažením 0,1% poly-L-lysinem (P8920) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě vysušena na vzduchu a poté promyta sterilní destilovanou vodou. 1 x 10⁵ primárních hipokampálních neuronů potkana E19 (R886N-10) bylo naneseno na krycí sklo potažené poly-L-lysinem do každé jamky čtyřjamkové destičky v Dulbeccově modifikovaném orlím médiu (DMEM) s 10% tepelně inaktivovaným koňským sérem. Po 24 až 48 hodinách od nanesení byly buňky transfekovány 1 μg plazmidu pCAG-GFP podle protokolu výrobce. Po 24 hodinách po transfekci bylo přibližně 10-20 % primárních neuronů GFP pozitivních. Čtyři dny po transfekci bylo na destičku nasazeno 2 x 10⁴ lidských OPC a kultivační médium pro neurony bylo nahrazeno médiem pro spontánní diferenciaci lidských OPC (SCM106). Společná kultivace lidských OPC a potkaních primárních neuronů byla ponechána při teplotě 37 °C v inkubátoru tkáňových kultur s 5 % CO₂ po dobu 21 dnů s výměnou média každé 2 až 3 dny.

Výsledky

Tři linie buněk nervových progenitorů byly testovány pro obohacení OPC. Z nich linie NPC odvozená od ESC ENStem-A a imortalizovaná linie lidských fetálních NSC (ReNcell VM) obsahovaly v kultuře OEM významný počet buněk A2B5- a GalC-pozitivních. Naproti tomu imortalizovaná linie lidských kortikálních NSC (ReNcell CX) nevykazovala významný rozdíl v expresi markerů mezi rodičovskou linií NSC a podmínkami cílené diferenciace (údaje nejsou uvedeny).

Obrázek 1 zobrazuje kvantitativní a reprezentativní snímky lidských NSC kultivovaných v původním médiu (rodičovské) nebo v médiu obohaceném o oligodendrocyty (OEM). Buňky ENStem- A (obrázek 1A a B) vykazovaly v kultuře OEM mírné zvýšení markeru progenitorů O2A, A2B5, a trojnásobné zvýšení markeru intermediárních oligodendrocytů, GalC. Naproti tomu buňky ReNcell VM (obrázek 1C a D) kultivované v OEM vykazovaly více než 6násobné zvýšení exprese A2B5 a méně než 2násobné zvýšení exprese GalC. To ilustruje, že i při stejném postupu obohacování reaguje každá linie NSC na malé molekuly a růstové faktory odlišně.

Obrázek 1. OPC odvozené z linií lidských neurálních kmenových buněk. Kvantitativní měření A2B5- nebo GalC-pozitivních buněk v (A) ENStem-A nebo (C) ReNcell VM-derived kulturách ve standardním médiu (rodičovské) nebo v médiu obohaceném o oligodendrocyty (OEM). Údaje byly vypočteny na základě tří náhodně vybraných polí a prezentovány jako průměr se standardní chybou. (B) a (D) ukazují reprezentativní snímky pro (A) a (C). Snímky byly pořízeny 20x objektivem. A2B5-Parental (B, D, vlevo nahoře); A2B5-OEM (B, D, vpravo nahoře); Gal C-Parental (B, D, vlevo dole); Gal-C-OEM (B, D, vpravo dole).

Abychom zjistili, zda lze OPC stabilně udržet v médiu obohaceném o oligodendrocyty, sledovali jsme rychlost proliferace buněk měřením doby zdvojení. Buňky se zdvojovaly každých 48 hodin po dobu nejméně 7 týdnů v kultuře (obrázek 2A) a bipolární morfologie naznačovala, že tyto buňky jsou ve fázi diferenciace neurální progenitor/oligodendrocytární progenitor.

Obrázek 2. Snímky proliferujících lidských OPC v jasném poli 24 hodin po rozmrazení (A) a po týdnu v kultuře (B). Lidské OPC se zdvojnásobují každých 48 hodin (C).

Dále jsme zkoumali expresi proteinů v buňkách OPC pomocí imunofluorescenčního barvení mezi 3. a 5. pasáží. Zaznamenali jsme vysoký počet buněk exprimujících Olig2 (92 %, obrázek 3A), Sox10 (81 %, obrázek 3B), O4 (82 %, obrázek 3C), NG2 (64 %, obrázek 3D) a GalC (80 %, obrázek 3E). Po 2 týdnech spontánní diferenciace se buňky proměnily v 50 až 70 % neuronů pozitivních na MAP2 nebo bIII-tubulin (obrázek 4) a méně než 5 % astrocytů pozitivních na GFAP (obrázek 4). U 30 až 50 % buněk byla zjištěna silná exprese markerů středních až pozdních oligodendrocytů MBP, PLP-1, MOG, RIP, GalC a NG2 (obrázek 4).

Obrázek 3. Charakterizace oligodendrocytárních progenitorových buněk. Lidské OPC exprimují markery raných oligodendrocytů Olig2, Sox10, O4, NG2 a GalC. Oligodendrocytární progenitorové buňky byly naneseny v počtu 10⁴ buněk/cm² na 24jamkové destičky potažené poly-L-ornitinem a lamininem.

Obrázek 4. Charakteristika zralých oligodendrocytů. Po 2 týdnech spontánní diferenciace vytvářejí lidské OPC přibližně 30 % zralých oligodendrocytů (MBP, MOG, PLP, RLP, RIP) a ~ 50 % neuronů (Tubulin, MAP2). Lidské OPC byly naneseny v počtu 10⁴ buněk/cm² na 24jamkové destičky potažené poly-L-ornitinem a lamininem v kompletním médiu pro expanzi lidských OPC. Dvacet čtyři hodin po nasazení byla zahájena spontánní diferenciace výměnou média za Human OPC Spontaneous Differentiation Complete Media.

Primární neurony potkanů izolované z embryonálního hipokampu jsou většinou pyramidové neurony, které mají charakteristickou morfologii složenou z jednotlivých axonů a mnohočetných dendritů. Pro usnadnění identifikace potkaních primárních neuronů byl transientní transfekcí vnesen zelený fluorescenční protein (GFP). Úspěšně bylo transfekováno 10-20 % buněk a exprese GFP byla stabilní po celou dobu pozorování. OPC odvozené z lidských ES buněk byly přidány ke kultuře primárních neuronů potkanů v poměru 1:5. Tři týdny po zahájení kokultivace jsme analyzovali relativní stupeň myelinizace pomocí imunofluorescenčního barvení. Myelinový bazický protein (MBP) je hlavní složkou myelinové pochvy. V nepřítomnosti lidských OPC vykazovaly primární neuronální kultury potkanů malé nebo žádné barvení na MBP (obrázek 5A). Naproti tomu v kokultuře obsahující axony značené GFP a lidské OPC bylo pozorováno významné barvení MBP (obrázek 5B). Exprese MBP kolokalizovala s jádry, což poskytuje důkaz, že MBP je exprimován z lidských OPC. Tato data naznačují, že v přítomnosti zralých nebo vyvíjejících se axonů mohou OPC odvozené z lidských ES buněk dále dozrávat na funkční oligodendrocyty, které jsou schopné produkovat myelin k ochraně axonů.

Obrázek 5. In-Vitro test myelinizace. OPC odvozené z lidských ES buněk (Human Nuclei+) myelinizují neurony (MBP+) při společné kultivaci s primárními neurony potkanů (A, B, C).

Závěry

Vyvinuli jsme stabilní linii kmenových buněk, která dokáže udržet vysoké procento progenitorů oligodendrocytů v kultuře a která by potenciálně mohla po spontánní diferenciaci poskytovat funkční oligodendrocyty produkující myelin. Buňky lze také použít ke screeningu molekul, které podporují nebo inhibují přežívání a diferenciaci lidských OPC. V současné době se snažíme identifikovat ty molekuly, které by zvýšily diferenciaci OPC. Tento vhodný a spolehlivý zdroj oligodendrocytů může pomoci pokročit ve výzkumu neurodegenerativních terapií nemocí, jako je roztroušená skleróza.

Často kladené otázky

Na jaké baňce pro tkáňové kultury mám buňky rozmrazit?

Jednu lahvičku s buňkami rozmrazte a naneste na baňku T25 potaženou matrigelem. Nedoporučuje se rozmrazovat na baňky větších rozměrů.

Na jakém průchodu jsou k dispozici buňky?

Buňky byly uloženy do banky v pasáži 3 a mohou být dvakrát expandovány. Buňky by se neměly používat po pasáži 6.

Kolikrát mohu buňky projít?

Buňky lze pasážovat dvakrát. Po rozmrazení jsou buňky v pasáži 4. Po dalších dvou pasážích jsou buňky v pasáži 6. Buňky by neměly být expandovány po pasáži 6.

Při jaké konfluenci bych měl buňky propustit?

Buňky by měly být pasážovány, když dosáhnou 80 % konfluence. Nedoporučuje se pasážovat buňky, když dosáhnou 100% konfluence.

Jaký je optimální poměr rozdělení?

Optimální hustota výsevu je 2 až 4 x 10⁴ / cm². To odpovídá 500 000 buněk na vhodně potažené baňce T25 nebo rozdělení 1:3 až 1:5.

Mohu své buňky zmrazit?

Ne, zmrazení buněk nedoporučujeme. Výkon buněk, které byly zmrazeny jednotlivými uživateli, nelze zaručit.

Mohu místo toho použít svá média?

Expanzní médium Human OPC bylo optimalizováno speciálně pro naše lidské OPC. Jiná média nebyla testována. V případě použití jiných kultivačních médií by měl uživatel buňky podrobně charakterizovat, aby se ujistil, že si zachovají správný fenotyp a barvicí vlastnosti.

Mohu použít soupravy Human OPC Expansion nebo Differentiation Media k expanzi, kultivaci a diferenciaci oligodendrocytů, které jsem získal od jiného dodavatele nebo které jsem izoloval sám?

Ne. Tato média byla optimalizována speciálně pro naše lidské OPC. Jiné typy buněk nebyly testovány. Nedomníváme se, že buňky získané z jiných zdrojů nebo přímo izolované z mozkových tkání se budou v systému médií chovat podobně.

Mohu k diferenciaci použít vlastní růstové faktory?

Jiné růstové faktory než ty, které jsou součástí sady, nebyly testovány. Pokud uživatel uvažuje o použití jiných růstových faktorů, doporučujeme mu použít dodanou sadu médií jako pozitivní kontrolu pro porovnání účinků jiných růstových faktorů a cytokinů na expanzi a diferenciaci lidských OPC.

Mohu na potah použít jiný ECM?

Jiné ECM než ty, které jsou uvedeny v sadě, nebyly testovány. Pokud uživatel uvažuje o použití jiných ECM, doporučujeme mu použít činidla a ECM uvedené v soupravě jako pozitivní kontrolu pro porovnání účinků jiných ECM na expanzi a diferenciaci lidských OPC.