Protokoly pro kultivaci neurálních kmenových buněk

Úvod
Metody
    Izolace nervových kmenových buněk
    Expanze neurálních kmenových buněk
.Často kladené otázky
Informace k objednávce

 

Úvod

Neurální kmenové buňky se vyznačují schopností 1) samoobnovovat se a 2) vytvářet různé typy buněk, které se vyskytují v centrálním nervovém systému, včetně neurálních i gliových podtypů. Izolace a in vitro analýza populací nervových progenitorových buněk jsou důležité pro rozluštění buněčných a molekulárních mechanismů, které jsou základem neurogeneze, a pro optimalizaci léčby neurologických poruch a zranění na bázi kmenových buněk. V mozku dospělých savců se NSC vyskytují především ve dvou neurogenních oblastech: v subgranulární zóně dentátového gyru (DG) hipokampu a v subventrikulární zóně (SVZ) postranních komor. Nedávno pomohlo použití pluripotentních kmenových buněk k vytvoření neurálních progenitorů odvozených od pacientů k vytvoření relevantnějších buněčných modelů "disease-in-a-dish" mnoha neurologických onemocnění souvisejících s věkem.

Obrázek 1. Oblasti neurogeneze v mozku savců. Proliferující nervové kmenové buňky se nacházejí v subgranulární zóně (SGZ) hipokampálního dentálního gyru a v subventrikulární zóně (SVZ) dospělého a vyvíjejícího se mozku savců.

Metody

Izolace neurálních kmenových buněk

Isolace NSC z neurální tkáně

1. Myši nebo potkani byli anestetizováni intraperitoneální injekcí buď 230 mg/kg pentobarbitalu sodného, nebo 400 mg/kg avertinu, po níž následovala eutanazie.
2. Odstranění mozku a přenesení do 50ml zkumavky do 10cm Petriho misky (CLS430591) obsahující 20 ml studeného roztoku A (1XHBSS (H8264) obsahující 30 mM glukózy (G7021), 2 mM Hepesu (H0887), 26 mM NaHCO3 (S5761)). Umístěte malý kousek filtračního papíru na Tissue Chopper, mírně navlhčete filtrační papír pomocí vlhkého sterilního tamponu a poté mozek na mokrý filtrační papír nasaďte pomocí kleští se zahnutou špičkou. Nakrájejte mozek na 400-uM koronální řezy a pomocí vlhkého sterilního tamponu odeberte řezy obsahující SVZ (~6 řezů) a hipokampus (~5 řezů) do 6cm Petriho misky (CLS430589) naplněné 5 ml roztoku A.
   Kritický krok: Petriho misku obsahující řezy mozku a roztok A udržujte během krájení a pitvy na ledu.
3. Pod pitevním mikroskopem vyřízněte SVZ a Dentate Gyrus (mapa mozku) a vyříznutou tkáň uchovávejte v samostatných 15ml zkumavkách Falcon (CLS430791), z nichž každá obsahuje 10 ml studeného roztoku A.
   Kritický krok: Tento a následující kroky jsou optimalizovány pro izolaci NSC z preparátu SVZ a DG jedné myši. Pokud plánujete izolovat buňky ze sdružených tkání více než jedné myši, doporučujeme přidat krok purifikace Percollem (P4937) k odstranění přebytečného myelinu a dalších typů buněk
4. Po dokončení pitvy všech mozkových řezů roztočte kousky tkáně v nízkootáčkové centrifuze při 200 g po dobu 1 min při pokojové teplotě (20-25 °C).
5. V digestoři TC odeberte supernatant a do každé 15ml kónické zkumavky obsahující kousky tkáně přidejte 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA  (59417C). Otáčejte kónické zkumavky při pokojové teplotě po dobu 10-20 min.
   Upozornění: Neinkubujte déle než 30 min, protože se tím sníží životaschopnost buněk.
6. Přidejte do každé zkumavky 1 ml µl roztoku inhibitoru trypsinu (T7659) a otáčejte dalších 10-20 min.
   Upozornění: Neinkubujte déle než 30 min, protože se tím sníží životaschopnost buněk.
7. Předem navlhčete ohněm leštěnou skleněnou pipetu, abyste tkáň tritulovali pipetováním nahoru a dolů 10-20krát, dokud se neobjeví žádný shluk tkáně, a poté do každé zkumavky přidejte 8 ml média N2 (DMEM/F-12 (D6429), doplněk N2 (SCM012), L-glutamin (G7513). Peletujte buňky při 200 g po dobu 5 min při pokojové teplotě.
   Upozornění: Při trituraci tkáně se vyvarujte vytváření vzduchových bublin, protože to sníží životaschopnost buněk.
   Kritický krok: Je důležité disociovat SVZ a DG na jednotlivé buňky, protože jakékoli zbývající agregáty mohou mít za následek snížení výtěžnosti.
8. Buňky dvakrát promyjte 10 ml média N2 a pokaždé odstřeďte při 200 g po dobu 5 min při pokojové teplotě.
9. Pokud izolujete buňky ze sdružených tkání 2 nebo více myší, znovu suspendujte každý buněčný pelet s 5,5 ml média N2, přidejte 5,5 ml roztoku Percoll/PBS a promíchejte převrácením zkumavek. Pelotujte buňky při 400 g po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Poté buňky třikrát promyjte 10 ml média N2 a pokaždé je roztočte při 200 g po dobu 5 min při pokojové teplotě, abyste buňky shromáždili.
   Kritický krok: Opatrně odstraňte supernatant, protože peleta nemusí být pevně spojena se dnem zkumavky. Kritický krok: Kritický je důkladné odstranění Percollu promytím, protože zbytky Percollu ovlivňují životaschopnost buněk.
10. Propláchněte ještě jednou 8 ml počátečního proliferačního média (IPM) (bazální médium pro neurální kmenové buňky (SCM003), B27 (SCM013), L-glutamin (G7513), 1X Pen-Strep (P4333), 20 ng/ml FGF-2 (F0291) a 20 ng/ml EGF (E9644)).
11. Každou buněčnou peletu znovu suspendujte s 1 ml IPM pro DG, 2 ml IPM pro SVZ, a poté buňky vložte do jedné jamky 24jamkové destičky pro tkáňové kultury (CLS3527) pro DG a do 2 jamek pro buňky SVZ. Inkubujte buňky v inkubátoru s CO₂ po dobu 48 h.
12. Vyměňte polovinu IPM, přičemž se vyvarujte odstranění buněk. Pokračujte v inkubaci buněk po dobu 7-14 dní, každý druhý den vyměňte polovinu IPM a sledujte buňky, zda se netvoří neurosféry. V obou kulturách by se měly vytvořit neurospheres za 1-2 týdny.

Diferenciace lidských iPSC na NSC

Dvojitá inhibice SMAD je dobře zavedená metoda odvození nervových progenitorových buněk z lidských ES/iPS buněk v jednovrstvých kulturách. Tento protokol používá dva inhibitory SMAD, Noggin (SRP4675) a SB431542 (S4317), k řízení rychlé diferenciace ES/iPS buněk na vysoce obohacenou populaci NPC. Noggin působí jako inhibitor BMP a SB431542 inhibuje dráhy Lefty/Activin/TGFβ blokováním fosforylace receptorů ALK4, ALK5 a ALK7. Ve snaze vytvořit definovanější a optimalizovanější protokol diferenciace neuronů Li a jeho kolegové upravili původní protokol a vytvořili diferenciační metodu založenou zcela na malých molekulách, která se opírá o tři malé molekuly inhibující signální dráhy GSK-3β, CHIR99021 (SML1046), TGFβ, SB431542 (S4317) a Notch, Compound E (565790), spolu s lidským LIF (LIF1010). Tento nový protokol neurální diferenciace založený na malých molekulách zvýšil kinetiku neurální diferenciace a umožnil odvození skutečně multipotentních neurálních kmenových buněk, které reagují na regionální vzorovací signály specifikující neurální a gliové subtypy předního, středního a zadního mozku.

Poznámka k použití: Robustní diferenciace lidských iPSC na neuronální a gliové buňky specifické pro danou linii s využitím duální inhibice SMAD

Charakterizace neurálních kmenových buněk

V současné době jsou nervové kmenové buňky často identifikovány na základě přítomnosti molekulárních markerů, které korelují s kmenovým a/nebo progenitorovým stavem spolu s absencí diferencovanějšího fenotypu, jak je hodnoceno pomocí analýzy markerů. NSC pozitivně exprimují markery kmenových buněk Nestin (ABD69, MAB353), Sox-2 (AB5603) a Musashi (MABE268) a postrádají markery diferencovanější linie, včetně βIII-tubulinu (MAB1637) pro neurony, GFAP (AB5804) pro astrocyty a O1 (MAB344) pro oligodendrocyty.

Tabulka 1. Markery nervových kmenových buněk

Typ buňky	Sox-2	Nestin	Musashi	b-Tubulin	Tubulin	GFAP	O1
Pluripotentní kmenové buňky	+	-	-	-	-	-
Neurální kmenové buňky	+	+	+	-	-	-
Neurony	-	-	-	+	-	-
Astrocyty	-	-	-	-	-	+	-	-
Oligodendrocyty	.-	-	-	-	-/td>	-	+

Expanze neurálních kmenových buněk

Kultivace NSC v 3D kultuře Neurosphere

13. Po 7-12 dnech kultivace neurospér (krok 1-15 výše) seberte všechny primární sféry, aniž byste narušili připojené buňky; odstřeďujte při 200 g po dobu 5 min při pokojové teplotě.
14. Opatrně odstraňte médium a do každé zkumavky přidejte 1 ml 0,05% trypsinu/EDTA (59417C). Disociujte kuličky pomocí modré špičky o objemu 1 ml pipetováním 20krát nahoru a dolů, aby se kuličky během 2 min. rozložily. Do každé zkumavky přidejte 1 ml roztoku inhibitoru trypsinu (T7659) a pipetujte ještě 10krát nahoru a dolů. Do každé zkumavky přidejte 5 ml IPM, promíchejte několikerým převrácením zkumavek a peletujte buňky při 200 g po dobu 5 min při pokojové teplotě.
15. Pelety buněk DG znovu rozpusťte v 1 ml IPM a pelety buněk SVZ ve 2 ml média N2. Zřeďte 10 µl alikvotní část z každého vzorku v 10 µl 0,5% trypanové modři (T8154) a spočítejte životaschopné buňky pomocí hemocytometru.
16. DG buňky umístěte do jedné jamky 24jamkové destičky a SVZ buňky do jedné jamky 6jamkové destičky a buňky inkubujte.
17. Vyměňte polovinu média za čerstvé IPM pro DG buňky a čerstvé médium N2 pro SVZ buňky každý druhý den po dobu 1 týdne. Při výměně poloviny média neodebírejte žádné buňky. Po první pasáži udržujte DG a SVZ NSC v médiu N2 a pasážujte NSC výsevem 3X10⁴ -1X10⁵ buněk/ml každé 2-3 dny.

Kultivace NSC ve 2D monovrstvé kultuře

Doporučujeme potahovat plastové nebo skleněné nádoby pro tkáňové kultury poly-L-ornitinem a lamininem. Poly-L-ornitin a laminin poskytují optimální matrici pro adhezi a růst NSC.

18. Poly-L-ornitin (P4957) zřeďte vodou ze zásobní koncentrace (0,5 %) a přidejte k němu další látky.1 mg/ml) tak, abyste získali: a. 20 μg/ml pro polystyrenové desky b. 50 μg/ml pro skleněné desky.
19. Přidejte takové množství roztoku poly-L-ornitinu, aby pokrylo celý povrch nádoby pro tkáňové kultury. Použijte 2 ml objemu pro 3,5 cm destičky, 5 ml objemu pro 6 cm destičky a 10 ml objemu pro 10 cm destičky a baňky T75. Inkubujte ve zvlhčeném inkubátoru při 37 °C po dobu nejméně jedné hodiny.
20. Odstraňte roztok poly-L-ornitinu a jednou jej opláchněte sterilní vodou. Po opláchnutí aspirujte.
21. Pro kultivaci, množení a diferenciaci NSC nařeďte laminin (L2020) na konečnou koncentraci 5 μg/ml. Použijte 2 ml objemu pro 3,5 cm destičky, 3-5 ml objemu pro 6 cm destičky a 7-10 ml objemu pro 10 cm destičky a baňky T75. Inkubujte ve zvlhčeném 37C inkubátoru po dobu nejméně 1 hodiny. Potažené destičky a baňky lze skladovat v roztoku lamininu při teplotě 2-8 °C po dobu 3 týdnů nebo při -20 °C po dobu 6-8 měsíců. Těsně před použitím zahřejte potažené destičky nebo baňky na pokojovou teplotu a odsajte roztok lamininu. Před použitím destičky jednou opláchněte 1X PBS (806552).
22. Vyjměte lahvičku s neurálními genitorovými buňkami (SCC007, SCC008, SCR055, SCC035) z tekutého dusíku a inkubujte ji ve vodní lázni o teplotě 37 °C. Pečlivě sledujte, dokud buňky zcela nerozmrznou. Maximální životaschopnost buněk je závislá na rychlém a úplném rozmrazení zmrazených buněk.
    DŮLEŽITÉ: Buňky nerozmíchávejte.
    
23. Jakmile jsou buňky zcela rozmrazeny, dezinfikujte vnější část lahvičky 70% etanolem. V laminární digestoři přeneste buňky pomocí 1 nebo 2ml pipety do sterilní 15ml kónické zkumavky. Dávejte pozor, abyste během přenosu nevytvořili žádné bubliny.
24. Pomocí 10ml pipety pomalu po kapkách přidejte 9 ml neurálního expanzního média (SCM005, SCM004) (předehřátého na 37 °C) do 15ml kónické zkumavky.
    DŮLEŽITÉ: Nepřidávejte k buňkám celý objem média najednou. To může mít za následek snížení životaschopnosti buněk v důsledku osmotického šoku.
    
25. Suspenzi buněk jemně promíchejte pomalým pipetováním dvakrát nahoru a dolů. Dávejte pozor, abyste nevnesli žádné bublinky.
    DŮLEŽITÉ: Buňky nevrtejte.
    
26. Centrifugujte zkumavku při pokojové teplotě při 200 x g po dobu 3-5 minut, aby se buňky peletovaly.
27. Dekantujte co nejvíce supernatantu.
28. Resuspendujte buňky v celkovém objemu 2 ml neurálního expanzního média (předehřátého na 37 °C) obsahujícího FGF-2, 20 ng/ml (F0291).
29. Směs buněk naneste na poly-L-ornitinem a lamininem potaženou destičku č. 3.5 cm.
    DŮLEŽITÉ: Pro optimální růst se nedoporučuje rozmrazovat buňky na deskách pro tkáňové kultury, které jsou větší než 3,5 cm.
    
30. Inkubujte buňky při teplotě 37 °C ve zvlhčeném inkubátoru s 5% obsahem CO₂.
31. Druhý den vyměňte médium za čerstvé Neural Expansion Medium (předehřáté na 37 °C) obsahující FGF-2 (20 ng/ml). Poté je každý druhý den vyměňte za čerstvé médium.
32. Když jsou buňky přibližně 90-100 % konfluentní, lze je disociovat pomocí Accutase™ (A6964) a pasážovat, případně zmrazit pro pozdější použití. Buňky by měly být po celou dobu udržovány ve vysoké buněčné hustotě, a proto se doporučuje pasážování v poměru 1:2 až 1:6.

Obrázek 2. Charakteristiky kultivace nervových kmenových buněk. NSC lze pěstovat jako plovoucí 3D neurokuličky (A) nebo připojené 2D monovrstvy (B) na deskách potažených poly-L-ornitinem/lamininem. Multipotentní neurální kmenové buňky exprimují Nestin (C) a Sox-2 (D).

Obrázek 3. Diferenciace nervových kmenových buněk. Multipotentní NSC exprimují Nestin/Sox-2 a za vhodných kultivačních podmínek se mohou diferencovat v BIII-Tubulin pozitivní neurony (B) nebo GFAP pozitivní astrocyty (C).

Často kladené otázky

1. Jaká je doba zdvojení NSC? Jak často se mají kultury dělit?
   Lidské NSC se zdvojují každých 48-72 hodin. NSC hlodavců se zdvojují každých 24 hodin. Buňky by měly být rozděleny v poměru 1:2 až 1:6, jakmile jsou z 80 % konfluentní, tedy zhruba každých 3-5 dní.
2. Moje buňky nepřilnou k destičkám potaženým P/L, co mohu udělat, abych vytvořil jednovrstvou kulturu NSC?
   Destičky potažené Poly-L-Ornithinem/Lamininem jsou vadné. Natřete nové destičky čerstvými roztoky Poly-L-Ornithinu/Lamininu
3. Moje buňky rostou pomalu, co se pokazilo?
   Každý den vyměňte médium, abyste zajistili rychlé množení. Používejte čerstvá média s čerstvě doplněným bFGF. Počkejte, až budou buňky 80-90 % konfluentní, a teprve poté je rozdělte v poměru 1:2 až 1:4. Zkontrolujte, zda se buňky nediferencovaly.
4. V mé kultuře je hodně odumírajících/plovoucích buněk. Je to normální?
   Jedná se o volně adherentní buněčnou kulturu a není neobvyklé, že v kultivačním médiu plavou buňky a zbytky buněk. Pokud adherentní buňky na destičce pěkně rostou v monovrstvě, nedělejte si s plovoucími buňkami starosti a budou odplaveny při výměně média.
5. Musím tyto buňky na destičku navázat v tak vysoké hustotě, nebo je mohu rozdělit v poměru 1:3 nebo 1:4?
   Na rozdíl od většiny systémů buněčných kultur je třeba tyto buňky navázat hustě, aby byly vysoce proliferativní. V kulturách s nižší hustotou je proliferace zpomalena pravděpodobně v důsledku ztráty kontaktu mezi buňkami. Ideální je pasážování buněk v poměru 1:2, pokud však buňky pěkně rostou, je možné je rozdělit v poměru 1:3.
6. Jak diferencujete buňky do specifických neurálních fenotypů?
   Dodaný diferenciační protokol/médium je určen jako základní systém. Pro specifické typy buněk lze vyvinout diferenciační protokoly včetně dalších neurotropních faktorů podle zájmu koncového uživatele.

Informace k objednání