優化 qPCR 條件
優化 qPCR 條件對於開發穩健的檢測非常重要。優化不佳的表現是重複品之間缺乏重現性，以及檢測效率低且不靈敏。這兩種主要方法是優化引物濃度和/或退火溫度。
一旦分析方法經過優化，就必須驗證反應效率。在報告和比較檢測時，此資訊非常重要。在本示例方案中，在寬和窄的 cDNA 濃度動態範圍內比較了檢測效率。在實際應用中，通常會根據樣本中目標物的預期範圍選擇單一範圍進行測試，因此可以根據實驗要求調整所給方案。在本例中，使用 10 倍和 2 倍稀釋系列計算效率。請注意，使用 ReadyScript® ；RT 套件時，cDNA 產量與 RNA 輸入量的比例是線性的，因此如果使用 RT-qPCR 系統，本實驗可以調整為 RT-qPCR，方法是 1) 稀釋 RNA 並執行 RT 反應，2) 然後在每個產生的 cDNA 樣品上執行 qPCR（請參閱 Reverse Transcription for examples）。 然而，情況並非總是如此，也並非適用於所有反轉錄套件或協議。
設備
- 定量 PCR 儀器
- 用於 PCR 設定的層流罩（選擇性）
試劑
- 用作標準曲線模板的 DNA（如.g.,cDNA、gDNA 或合成模板）。
- KiCqStart SYBR® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03
- PCR 級水：PCR 級水（W4502），20 mL 等分，冷凍；每次反應使用新的等分。
- 測試基因的正向和反向引物（10 μM）。
耗材
- 無菌過濾器 無菌 1.5 mL 螺旋蓋微量離心管 (CLS430909)
- PCR 管和板，請選擇符合所需格式的一種：
- 獨立薄壁 200 μL PCR 管 (Z374873)
- 板
- 96孔板(Z374903)
- 384孔板 (Z374911)
- 板封
- ThermalSeal RTS™ 密封膜 (Z734438)
- 熱封 RT2RR™ 膜 (Z722553)
本規程的注意事項
- 使用隨機引物或oligo-dT方法產生cDNA（見 標準反轉轉錄協議（兩步法））。將 RT 產品稀釋以準備標準曲線（以 1:2 和 1:10 為例）。也可以使用 ReadyScript® 試劑盒稀釋 RNA 並從每個稀釋液中合成 cDNA，或者稀釋 RNA 並按照 Reverse Transcription Protocol (One-step SYBR® Reverse Transcription Protocol (One-step SYBR® Green I) 中的一步 RT-qPCR 方法，採用一步 RT-qPCR 方法。® Green I Dye Detection） 和 反轉錄協議（一步探針檢測）。另外，也可以使用 DNA 樣板來取代，使預期的 Cq 範圍在 Cq 15 到 Cq 38 之間。
- 每個濃度的序列稀釋物將以重複反應的方式執行。
方法
1. 按照 表 2 準備足夠進行 40 個反應的 qPCR 母液。由於要運行 32 個反應（表 3），因此要預留額外的
以容納移液錯誤。
2. 稀釋DNA，經過1:10和1:2的系列，每個系列涵蓋7個稀釋點 （表3，DNA稀釋的平板佈局）。
3. 在指定孔中加入5 μL適當的模板稀釋液（表3，DNA稀釋的平板布局）。
4. 每孔加入 15 μL 母液（表 3）。
5. 蓋上試管或封板並標籤。(
5. 蓋上試管或封好平板並打上標籤（確保標籤不會遮擋儀器的激發/檢測
6. 按照下面的兩步驟運行樣品。重複步驟 1-2 至 40 個週期。按照
注意： 使用標準解離曲線協議（數據收集）。
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