寡核苷酸定量

What is Oligonucleotide Quantification?

寡核苷酸定量是測定溶液中寡核苷酸（核酸 (DNA 或 RNA) 的短單鏈或雙鏈聚合物）濃度的過程。此測量對於分子生物學、生物科技和臨床診斷的各種應用是非常重要的。

寡核苷酸定量的用途

• 精確的實驗設定：精確的定量可確保在 PCR、qPCR、測序和雜交分析等實驗中使用正確劑量的寡核苷酸。這種精確度對於重複性和結果的可靠性至關重要。
• 品質控制：定量有助於評估寡核苷酸的純度和完整性。任何污染或降解都會影響實驗結果，因此定期定量對於維持品質標準是必要的：在臨床和診斷應用中，標準化的寡核苷酸濃度對於確保不同檢測和實驗室的性能一致非常必要：瞭解寡核苷酸的精確濃度可讓研究人員優化反應條件，確保基因合成、RNA 干擾和 CRISPR-Cas9 基因編輯等程序的效率和效能。

準確可靠的寡核苷酸定量的常見陷阱和技巧

• 適當稀釋樣品：稀釋高濃度的寡核苷酸溶液，使其在定量方法（如紫外分光光度法）的線性範圍內，以避免飽和並確保讀數的準確性：測量吸光度比率 (A260/A280) 以評估寡核苷酸的純度。DNA 的吸光比為 ~1.8 而 RNA 的吸光比為 ~2.0 表示樣品純淨，偏差可能表示受到蛋白質或其他雜質的污染：根據 260 nm 的吸光度計算濃度時，確保使用正確的消光係數。該系數取決於寡核苷酸的特定序列和組成。
• 避免污染：使用不含核酸的水和乾淨的玻璃器皿，避免污染影響定量的準確性。鹽和有機化合物等污染物會干擾吸光度讀數。
• 正確儲存寡核苷酸：將寡核苷酸溶液儲存於建議的溫度（通常為 -20°C 或 -80°C），並避免反覆凍融循環，因為這可能會導致降解和不準確的定量：對於低濃度的樣品，可考慮使用以螢光為基礎的定量方法，這種方法比 UV 吸光更靈敏，可檢測較低濃度的寡核苷酸。

如何定量寡核苷酸

溶液中的核酸濃度在分光光度計中很容易在 260 nm 紫外光 (UV) 下定量（圖 1）。此技術之所以有效，是因為碱基具有共轭双键，對紫外光的吸收不同。

圖 1.分光光度計中的吸光率。 樣品池中溶液中的核酸會以最大強度的 260 奈米入射紫外光照射。由於核酸碱基吸收部分紫外光，因此透射紫外光的強度降低。吸光率由以下公式決定：

其中： A₂₆₀ = 在 260 nm 處的吸光度；I_o = 入射光的強度；以及，I = 透射光的強度。

在吸光度讀數之後，Beer-Lambert定律開始發揮作用，因為它將吸光度與吸收核酸的濃度關係如下：

其中：

A₂₆₀ = 在 260 nm 的吸光度

��₂₆₀ ；= 寡核苷酸在 260 nm 處的消光係數，單位為 L ⋅ mol^-1 ⋅cm^-1

c ；   = 濃度，單位 mol L^-1

ℓ    = 路徑長度，單位 cm

Beer-Lambert 定律的關鍵在於消光係數，它量度吸收基在紫外線從入射到穿透的過程中，降低紫外線強度的程度。由於每個碱基的吸光率不同，碱基組合、碱基順序和序列長度都會影響進行定量的特定核酸的最終吸光率。因此，當計算出每個寡核苷酸的消光係數時，就能達到最高的精確度。最近鄰模型是寡核苷酸的理想選擇，其計算公式如下：

表 1 和表 2 顯示在計算寡核苷酸的最終總消光係數時，最近鄰公式中使用的最近鄰和單個碱基消光係數。

表 1. 最近鄰消光係數 (L ⋅ mol-1⋅ cm-1) 最近鄰公式將最近鄰項中的碱基視為二核苷酸，因此消光係數是從 5「 到 3」 位置讀取來決定配對的。例如，對於四核苷酸 5'-ACGT-3'，有三個二核苷酸 (AC、CG 和 GT)。這些核苷酸對的消光係數分別為 21,200、18,000 及 20,000 L ⋅ mol-1 ⋅ cm-1。

	3' 位置
5' 位置	Bases	A	C	G	T
	A	27,400	21,200	22,800
	C	21,200	14,600	18,000	15,200
	C
	G	25,200	17,600	21,600	20,000
T	23,400	19,000	16,800

表 2.以 L⋅ mol-1⋅ cm-1 為單位的個別基準消光係數 最近鄰公式會個別處理個別基元項中的基元，因此消光係數是每個基元一個。

Base
A	C	G	T
15,400	7,400	11,500	8,700

鑒於樣品池的路徑長度為 1.0 cm，Beer-Lambert 定律的所有輸入現在都已計算在內，因此可以重新排列等式來計算相關寡核苷酸的濃度。

為了計算濃度，Beer-Lambert 定律重新排列如下：

範例：5'-ACGT-3'

第一步：計算消光係數

��₂₆₀ = (AC+CG+GT)-(C+G) L ⋅ mol^-1 ⋅ cm^-1

��₂₆₀ = (21,200+18,000+20,000)-(7,400+11,500) L⋅ mol^-1 ⋅cm-1

��₂₆₀ = 40,300 L⋅ mol^-1 ⋅ cm^-1

在所有技術線上顯示器和列印文件上，上述 40,300 的值會顯示為 40。3.這是因為單位是 L ⋅ mmol^-1 ⋅cm^-1 （毫摩爾而非摩爾）。

第二步：計算濃度

A₂₆₀ 設定為 1.0 光密度 (OD) 單位

步驟三：計算摩爾質量 (MM)

通常使用 「分子量 」代替 「摩爾質量」，但由於這些計算需要摩爾的質量單位，因此 「摩爾質量 」是最正確的術語。此外，為了簡化顯示，上述各基底的摩爾質量已四捨五入至最接近的整數。因此，計算出的值 1,170 略低於真實的值 1,173.83。

第四步：將濃度轉換為慣例單位

因此，對於此特定序列：5'-ACGT-3'，1 OD = 29.0 µg mL^-1 （1 OD 是指 1 mL 溶液中的寡核苷酸量在 1.0 cm 的光路長度下顯示出 1.0 的 A₂₆₀ ）。0，光路長度為 1.0 cm）。作為比較，以下是由我們的線上寡核苷酸序列計算機 OligoEvaluator™ 釐定的數值：

手動計算出的值 29.0 與 OligoEvaluator 計算出的值 29.1 非常吻合（出現差異的原因是手動計算時使用了每個碱基的圓整摩爾質量，如上文第三步所述）。

除了 OligoEvaluator 之外，29.1 也是隨此寡核苷酸提供的技術資料表上會顯示的值。

5'-ACGT-3'的捷徑計算

上述長式計算步驟相當繁瑣。以下公式將所有步驟合二為一，因此可作為捷徑使用：

 

改性

標準寡核苷酸和改性寡核苷酸在濃度計算上的唯一差別是，改性的摩爾質量會被考慮在內，並加入寡核苷酸的總摩爾質量中。例如，如果我們上述的序列：

●    5'-ACGT-3'

變更為

●     5'-6-FAM™-ACGT-3'

而且，新的摩爾質量為1,711.3 g mol^-1 inserted into either the longform calculations or shortcut formula, the new concentration is

.

此值與 OligoEvaluator 斷定的值非常吻合：

快速換算

作為經驗法則，實驗驗證了以下快速換算（ds = 雙股；ss = 單股）：

●    A₂₆₀ dsDNA = 50 µg mL^-1
●     A₂₆₀ ssDNA = 37 µg mL^-1
●      A₂₆₀ ssRNA = 40 µg mL^-1

在沒有進行任何計算的情況下，這些轉換因子對於 A、C、G 和 T 碱基分佈較為平均的較長序列提供了合理的估計，例如那些由基因組 DNA 剪切所產生的序列（用於 dsDNA 估計）。然而，對於寡核苷酸，其碱基組合較可能偏斜，因此這些估算並不可靠 (通常會高估濃度)。每種寡核苷酸的濃度都必須如上所述，使用長式計算或捷徑計算來決定。長式計算或捷徑計算均可用於驗證技術資料表提供的定量值。