逆转录
逆转录(RT)是指使用逆转录酶和dNTP将RNA转化为cDNA的过程。该过程既可对总RNA进行RT步骤，从而产生代表样品中所有RNA转录本的整体cDNA（通常通过两步法），也可通过基因特异性方法，仅将目标RNA转化为cDNA（通常遵循一步法）。
下述实验可用作RT基础实验方案，供研究人员对其进行修改以满足特定要求。通常使用两步法制备cDNA，随后在加入PCR / qPCR体系之前对cDNA进行稀释，或者通过一步法反应进行制备，依次进行两个过程。
设备
- 定量PCR仪器
- 用于RT-qPCR设置的层流罩（可选）
试剂
- RNA（约1μg/μL储存液）
- SYBR Green 定量RT-PCR试剂盒（货号QR0100）
- PCR级水：PCR级水（货号W1754或W4502），20mL等分试样；冻存；每次反应均使用新鲜的等分试样。
- 正向和反向PCR引物（10μM工作原液）：
耗材
- 无菌过滤器移液管吸头
- 无菌1.5 mL螺纹盖微量离心管（货号CLS430909）
- PCR管和PCR板，选择一种以匹配所需格式：
- 单个薄壁200 μL PCR管（货号Z374873或P3114）
- 孔板
- 96孔板（货号Z374903）
- 384孔板（货号Z374911） - 封板膜
- ThermalSeal RTS™封膜（货号Z734438）
- ThermalSeal RT2RR™膜（货号Z722553）
方法
在下面给出的实验案例中，研究人员可以根据优化实验的结果对引物浓度进行调节（参见引物浓度优化、温度梯度法引物优化和检测方法优化和验证章节）。
- 将试剂盒组分和RNA样品置于冰上。
- 混合然后短暂离心以收集管底部的内容物。
- 为每个反应和对照准备一份预混液，并根据表P11-28，额外添加10％的RT酶以允许移液误差
。 - 为每个对照组准备一个预混液，并根据
表P11-28，额外添加10％的PCR级水（而非RT酶）代替酶以允许移液误差。
- 向每个PCR管中加入1μL总RNA（每次反应250-2500ng）。如果使用PCR板，请按照板示意图进行操作，以确保将反应混合物、样品和对照物加入到正确的孔中。
- 向每个孔中加入24μL 预混液，将无RT混合物添加至负RT对照样品中。
- 密封每个反应或孔板后，轻轻涡旋以混合内容物。
- 短暂离心以收集反应管底部的组分。
- 根据表P11-29设置实时qPCR。
- 进行反应后熔融分析。
材料
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