使用溫度梯度優化底劑

優化 qPCR 條件

優化 qPCR 條件對於開發穩健的檢測非常重要。優化不佳的表現是重複品之間缺乏重現性，以及檢測效率低且不靈敏。兩個主要的方法是引物濃度和/或退火溫度的最佳化。

化驗最佳化的一種方法是在一定範圍的退火溫度下測試含有固定引物濃度的相同反應，從而確定引物的最佳退火溫度 (T_a)。如果有帶有溫度梯度塊的 qPCR 儀器，就可以實現這一目標。在本方案中的格式中，引物的最終濃度為 450 nM，梯度的方向橫跨塊的 X 軸，使所有柱子都承受相同的 T_a （即 12 個不同的溫度）。在其他儀器中，梯度沿列向下，使所有行具有相同的 T_a （即 8 種不同的溫度）。以下方案可應用於任何一種儀器，儘管需要稍作修改。

設備

• 具有整合梯度塊控制功能的定量 PCR 儀器
用於 PCR 設定的層流罩（可選）

試劑

• cDNA 稀釋 1：5-1:10，gDNA 10ng，合成寡核苷酸（10,000 份）或其他適合優化的模板。
• KiCqStart SYBR^® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03; 儀器特定，請參閱 表 P17-42)。
• PCR級水：PCR 級水（W4502），20 mL 等分，冷凍；每個反應使用一個新的等分。
• 正向和反向引物濃縮庫存（10 μM工作庫存：GOI）。
  -   定制寡核苷酸可在 sigmaaldrich.com/oligos.

表 P17-42.SYBR Green PCR 混合液選擇指南

Hot Start ReadyMixes (Taq, Buffer, dNTPs, Reference Dye, MgCl2)
KiCqStart® SYBR Green qPCR ReadyMix™, Cat.No.KCQS00	KiCqStart® SYBR Green qPCR ReadyMix™ Low Rox , Cat.No.KCQS01	KiCqStart® SYBR Green qPCR ReadyMix™ with ROX, Cat.No.KCQS02	KiCqStart® SYBR Green qPCR ReadyMix™ for iQ, Cat.No.KCQS03
相容儀器：	相容儀器：	相容儀器：	相容儀器：	相容儀器：
Bio-Rad CFX384™	Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems 5700	Bio-Rad iCycler iQ™
Bio-Rad CFX96™	Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems 7000	Bio-Rad iQ™5
Bio-Rad MiniOpticon™	Fast Applied Biosystems ViiA 7	Applied Biosystems 7300 USB 3.0及PCI Express Gen 3.0高速傳輸介面	Bio-Rad公司的MyiQ™
Bio-Rad公司的MyiQ™	Stratagene公司的Mx3000P®	Applied Biosystems 7700
Bio-Rad/MJ Chromo4™	Stratagene Mx3005P™	應用生物系統公司 7900
Bio-Rad/MJ Opticon 2	Stratagene Mx4000™	Applied Biosystems 7900 HT Fast
Bio-Rad/MJ Opticon®		應用生物系統公司7900HT
Cepheid SmartCycler®		應用生物系統StepOnePlus™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex		應用生物系統StepOne™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s		；
Illumina Eco qPCR<
Qiagen/Corbett Rotor-Gene®
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q
Roche LightCycler® 480

耗材

• 無菌過濾器 移液管吸頭
• 無菌 1.5 mL 螺旋蓋微量離心管 (CLS430909)
• PCR 管和板，請選擇符合所需格式的一種：
  -   獨立薄壁 200 μL PCR 管 (Z374873
  )。Z374873 or P3114)
  -    平板
        - 96孔板(Z374903)。
        - 384孔板 (Z374911)
  -    板密封件
       - ThermalSeal RTS™ 密封膜 (Z734438)
        - 熱封RT2RR™薄膜  (Z722553)

本規程的注意事項

• cDNA使用隨機引物或oligo-dT引物方法產生，稀釋1：10，但也可使用任何合適的替代模板。
• 所有反應均以一式兩份的技術複本進行。
• 若使用 PCR 試劑板，請遵循試劑板示意圖（如：所示）、圖 P14-19所示），以確保反應混合物、樣本
  和對照被加入到正確的孔中。

 

方法

1.     根據 表 P14-35 準備 56 個反應的混合母液。攪拌均勻，避免產生氣泡。

表 P14-35.用於 Ta 優化的反應母液混合物

Reagents	每 單次 20 μL 反應的容量 (μL)	56 次反應的容量 (μL)
KiCqStart SYBR® Green qPCR ReadyMix 2×	10	560
Forward primer (10 μM)	0.9	50.4
反向引物 (10 μM)	0.9	50.4
PCR 級水	4.2	235.2

2.    從步驟 1 中取出 448 μL 母液（即、

3.     在步驟 2 剩餘的母液中加入 112 μL 模板。將模板母液置於冰上。

4.    在步驟 2 的另一半母液中加入 112 μL 水。

5.    将步骤 3 中的 20 μL 模板母液分装到标有 GOI 的 PCR 板上的两行中。    將步驟 4 中的 20 μL NTC 母液分別加入標有 NTC 的 PCR 試板的兩行。(

7.    蓋上平板並貼上標籤（確保標籤不會遮擋儀器的激發/檢測光路）。     按照下面的三步程序運行樣品
      （注意： These conditions are specific for FAST cycling protocols) ensuring that the annealing temperature has been
       定義適用於引物的最低和最高溫度之間的梯度（示例顯示
    54-70 °C）。重複步驟 1-3 至 40 個循環。在擴增之後，運行標準解離曲線。

表 P14-36.FAST qPCR 迴圈條件的 Ta 優化

FAST 循環條件	溫度 (°C)	時間 (sec)<
初始變性/熱啟動	95	30
步驟 1-3重複40週期
Step 1	95	5
Step 2	54-70 (梯度)	15
步驟 3	72	10

注意： 使用標準解離曲線協議（數據收集）。

圖 P14-19. Ta 最佳化的板材佈局，每根柱的 Ta 完全相同。

注意： 樣品和對照在整個溫度梯度上的分佈。如果儀器的溫度梯度是沿著板柱垂直變化的，樣品和對照需要相應地重新排列。

材料

抱歉，發生意外錯誤。

Network error: Failed to fetch