产品描述
面向全基因组扩增(WGA)的SeqPlexDNA扩增试剂盒(SEQXE)专用于对极小量或降解/高度片段化的DNA进行下一代测序(NGS)。染色质免疫沉淀(ChIP)或福尔马林固定的石蜡包埋组织样品（FFPE）的DNA含量往往无法满足成功制备下一代测序文库的需求。通过SeqPlex试剂盒可对这类DNA以及其他用于NGS的小量/高度片段化DNA样品进行预扩增。
SeqPlex流程包含三个步骤：预扩增、扩增和引物去除。参见以下SeqPlex工作流程图。
| 试剂 | 货号 | 10 RXN | 50 RXN | 500 RXN |
|---|---|---|---|---|
| 文库制备缓冲液 | LP100 | 20 µL | 100 µL | 1000 µL |
| 文库制备酶 | E0531 | 10 µL | 50 µL | 500 µL |
| 5x 扩增混合液 | A5112 | 235 µL | 1.15 mL | 11.5 mL |
| SeqPlex DNA聚合酶 | SP300 | 20 µL | 100 µL | 1 mL |
| 10x 引物去除缓冲液 | SR401 | 165 µL | 825 µL | 8.2 mL |
| 引物去除酶 | SR402 | 42 µL | 210 µL | 2 mL |
| 引物去除溶液 | SR400 | 33 µL | 165 µL | 1.6 mL |
| 水，分子生物学级别试剂 | W4502 | 5 mL | 25 mL | 220mL |
储存方法/稳定性
所有组分应储存在-20°C条件下。解冻使用时，所有组分应保存在冰上。通过在37℃条件下短暂加热并充分混合，以溶解溶液中的任何可能沉淀物。若储存在–20 °C以上环境或长期放置在4 °C以上环境中，会影响文库制备酶和引物去除酶的稳定性。
操作流程
以下步骤已成功用于扩增和测序100 pg的ChIP分离DNA和100 pg的片段化基因组DNA。受损DNA，如从FFPE组织中分离出来的DNA，可能需要5-10倍的起始DNA量——具体取决于DNA的受损程度。反应可以放大或缩小，以便制备所需数量的扩增DNA。
注意：扩增和引物去除后的最终得率很大程度上取决于起始DNA的量。在大部分情况下，可得到1-2μg。多次反应可获得更多产物。
注意：该操作步骤是应使用本试剂盒随附或推荐使用的试剂开发的。更换试剂可能无法获得最佳结果。
预扩增
- 为获得最佳的SeqPlex扩增覆盖度和NGS结果，最佳起始DNA大小为200-500bp。许多ChIP和FFPE样品的DNA已经在此范围内。在SeqPlex实验方案的第4步之前，这些样品不需要额外的片段化处理。
如果起始DNA不在200-500 bp范围内，强烈建议进行片段化处理。使用超声处理、Covaris仪器或者酶解法均可将DNA片段化。
- 尽可能通过紫外吸收(260 nm)测定DNA浓度，并且每个反应最多使用1 ng DNA。
- 解冻文库制备缓冲液（LP100）、5x扩增缓冲液（A5112）和水 (W4502)。充分混匀。
- 按下述方法添加溶液：
2 µL 文库制备缓冲液 (LP100)
X µL DNA（最多1 ng）
Y µL水 (W4502)
--------------------------------------------------
14 µL 总反应体积
注意—GenomePlex® WGA资深用户：SeqPlex增强型DNA扩增试剂盒（SEQXE）、SeqPlex DNA扩增试剂盒（SEQX）、GenomePlex WGA试剂盒、Transplex®WTA1试剂盒和完整全转录组扩增试剂盒(WTA2) 中的几个组分具有相似的名字。尽管它们的功能相近, 但不可互换使用。
- 充分混匀，短暂离心，然后在热循环仪中以下列程序孵育：
95 °C，2分钟
4 °C，保温
- 样品冷却至4°C后，加入1 µL文库制备酶（E0531）。盖上管盖并充分混匀。短暂离心并立即进入下一步。
- 将反应置于热循环仪中
并以下列程序孵育：
16 °C，20分钟
24 °C，20分钟
37 °C，20分钟
75 °C，5分钟
4 °C，维持
- 从热循环仪中取出样品并短暂离心。可立即完成扩增或将预扩增产物在-20 °C保存最长3天。
注意—GenomePlex WGA资深用户：
· SeqPlex使用5x扩增混合液
· 推荐使用SYBR Green (S9430) 监测扩增过程
· 退火/延伸温度为70 oC
· 扩增后需要在 70 oC 维持 30 分钟
- 在第8步获得的15 mL预扩增产物中加入下列试剂。（多次反应可能需要制备预混液。向每个反应中加入60 mL预混液）：
15 µL 5X 扩增混合液 (A5112)
1.5 µL SeqPlex DNA聚合酶 (SP300)
42.5 µL 水 (W4502)
1 µL 稀释1/1000的 SYBR Green I (S9430) *
- µL 仪器专用参比染料（可选）
--------------------------------------------------
75 µL总反应体积
*为了获得最好的效果，强烈建议在进行实时PCR时在扩增反应中加入SYBRGreen I，以监测反应过程。为避免抑制扩增反应，SYBRGreen I (S9430) 必须稀释1,000倍（1/1000）并且每个75 µl SeqPlex扩增反应仅使用1µl稀释液。除S9430外，其他SYBRGreen配方未经过测试，不推荐使用。
在扩增“平台期”开始后至少2-3个循环时，可达到最佳效果，如图1所示。最佳扩增循环数取决于起始DNA模板的数量和质量。
如果扩增反应不添加SYBRGreen I，使用0.1-1.0 ng高质量DNA通常可在18-24个循环获得良好结果。低质量DNA可能需要更高的起始量和/或更多的循环。如果起始量接近
10 pg，则可能需要多达29个循环才能到达扩增平台期。
注意：如果达到平台期需要的循环数超过29个，则后续的NGS结果可能会不符合要求。请查看故障排除指南。
10.充分混匀，并按以下设置在实时荧光定量热循环仪中运行：
初始变性：94 °C，2分钟
循环至平台期开始后的2-3个循环：
94 °C变性15秒
70 °C退火/延伸5分钟
（读取荧光值）
循环后：
70 °C，30分钟
4 °C，保温
注意：循环后在70°C的延伸孵育对于有效去除引物至关重要。
反应物可立即纯化或先保存在–20 °C。
11.使用GenElute PCR Clean-Up Kit (NA1020)进行纯化。使用50 µL无核酸酶的水进行洗脱。
12.通过测量260nm处的吸光度，测定纯化DNA的浓度。每A260单位等同于50ng/uL DNA。在该点的得率取决于起始DNA的质量，但通常在1-5 µg范围内。
注意：其他测量技术，如PicoGreen®，通常会低估实际SeqPlex DNA得率。
此时，SeqPlex DNA适用于qPCR和基因芯片。为进行深度测序，建议去除SeqPlex引物。
可选: 可通过凝胶电泳或毛细管电泳评估扩增质量。一般情况下，毛细管芯片需要1µL的粗扩增产物或纯化扩增产物，如Agilent生物分析仪，而琼脂糖凝胶电泳通常需要5 µL。
引物去除
注意—GenomePlex WGA资深用户：
SeqPlex增强型(SEQXE) 引物去除试剂不适用于采用上一代SeqPlex (SEQX)或GenomePlex (WGA1-5)扩增获得的DNA。
为获得足以满足大部分深度测序工作流程需要的产物量(>1μg)，建议的反应起始量为2.1 μg。
13.在冰上完成以下试剂添加步骤：
8.0 µL - 10x 引物去除缓冲液 (SR401)
1.6 µL - 引物去除溶液 (SR400)
X µL – 2.1 μg 纯化 SeqPlex DNA
Y µL - 水 (W4502)
--------------------------------------------------
76.25 µL 总反应体积
14混匀。如果要进行可选的引物去除测定（参见附录1），则取出5 µL 置于独立试管中，作为“无引物去除酶”对照。
15向第13步剩余的71.25 µL反应液中加入3.75 µL引物去除酶(SR402)。
16按以下设置，孵育有酶和无酶反应：
37 °C，60分钟
65 °C，20分钟
4 °C，保温
17从热循环仪中取出反应物，短暂离心并混匀。反应物可在–20 °C保存最多3天，也可立即纯化。
18如果要进行可选的引物去除测定，则在纯化前从“有引物去除酶”反应物中取出5 µL并保存（参见附录1）。
19按之前第10步所述方法，使用GenElute PCR Clean-up Kit的引物去除酶纯化剩余的反应物。
测序
SeqPlex DNA现在可立即用于下一代测序工作流程，包括末端制备，但通常不需要片段化或大小筛选。大部分SeqPlex DNA的长度介于200-500个碱基对之间。尽管通常没有必要，但可通过物理或酶解方法进行额外的片段化处理。
去除引物后，每个SeqPlex扩增子末端将具有一个5’-磷酸和一个2-碱基的3 '-突出端。在进行测序引物连接之前，采用T4聚合酶对双链片段的两端进行修复。
在引物去除处理后，任何保留引物的SeqPlex扩增子将具有一个5 ' -羟基。无需T4 DNA激酶处理，并且其缺失将减少测序引物与任何残留的未消化SeqPlex引物的连接。
Illumina工作流程中的3 ' -腺苷酸化在很大程度上阻止了连接产物的出现，如嵌合体。嵌合体已被报道出现于Roche 454文库制备和测序中。对于ABI SoLID测序，测序前的二次筛分步骤可能有助于减少嵌合体或串联体。
产物分析
该试剂盒已被证明可用于扩增ChIP DNA样品和全基因组片段化DNA模板。请注意，高复杂度DNA样品（如ChIP输入DNA）与低复杂度DNA样品（如ChIPed DNA）中的相同序列可能具有不同的扩增程度。因此，最好以复杂度相近的样品进行扩增程度比较，如来自经处理和未处理细胞或肿瘤和正常组织的ChIPed DNA。
SeqPlex DNA已成功用于为采用标准Illumina工作流程方案的Illumina GAIIx和MiSeq制备测序样品，包括：末端制备、精修、扩增和大小筛选。
在将样品用于下一代测序前，我们强烈建议在引物去除后使用已知存在于起始DNA中的短（<300bp）DNA序列的引物进行PCR，以确认SeqPlex DNA的质量。
注意：含有5’-CTGAAG-3’或5’-CTTCAG-3’序列的PCR产物或引物在去除引物后不会扩增。
在去除引物后不会扩增的PCR产物实例：
在引物去除之前或之后，SeqPlex DNA中的特定靶点也可通过PCR或基因芯片来确认。
SeqPlex DNA的稳定性与在相同条件下储存的基因组DNA相当。
附录1
可选: 引物去除检测
使用5X扩增混合液(A5112)、SeqPlex DNA聚合酶(SP300)和5 µL来自上述第18和14步的“有”和“无引物去除酶”剩余样品，通过qPCR评估引物去除效率。试剂盒提供的5X扩增混合液和DNA聚合酶足以用于每个扩增反应中“有”和“无引物去除酶”样品的引物去除检测。
- 将“有”和“无引物去除酶”样品连续稀释1,000,000倍（如，将1 µL样品稀释于99 µL水中，连续稀释3次）。
- 为上述两个样品制备检测混合液
6.6 µL 5X 扩增混合液 (A5112)
0.33 µL SeqPlex DNA聚合酶 (SP300)
0.33 µL SYBR Green (S9430) 的1/1,000稀释液，稀释剂为水
3.75 µL 水 (W4502)
注：每次检测需求体积较小的试剂可以在添加前用水稀释，以避免测量不准确，或者可以为多次检测制备测定预混液。
- 取1,000,000倍稀释的SeqPlex“有”和“无”酶样品各10 µL，分别置于独立的PCR管或孔中。
- 向第3步的两份10 µL1,000,000倍稀释SeqPlex产物中分别加入5 µL来自第2步的测定混合液。
- 按以下设置进行扩增：
94 ºC，2分钟。
30 - 35个循环*
94° C，15 秒
70° C，5分钟（读取）
如果在至少4个循环时，“有”引物去除酶反应的Ct/Cq值大于“无”酶反应的Ct/Cq值，表明引物去除成功。
参考文献
故障排除指南 | ||
|---|---|---|
| 观测结果 | 原因 | 建议解决方案 |
| 扩增后未检测到产物。 | 退火/延伸温度或时间有误 | 重新运行反应，条件为每个循环以70 °C退火/延伸5分钟。 |
| 扩增期间PCR循环数过少 | 以更多循环数（最多29个）重新运行反应，并使用SYBR Green监测实时荧光定量热循环仪中的扩增 | |
| 起始DNA不足或降解过于严重 | 以更多起始DNA重新运行反应 | |
| 在实时荧光定量PCR (qPCR)监测期间，未观察到扩增曲线 | 未添加SYBR Green | SeqPlex试剂盒中不包含SYBR Green I（货号S9430），但监测实时荧光定量PCR时必须添加该试剂。 |
| 可能需要qPCR仪专用参比染料 | 加入仪器专用参照染料。如果不能添加参照染料，则应增加循环数以确保完成全部循环。有关其他帮助，参阅FAQ。 | |
| 引物去除后检测到过多（>60%）或全部SeqPlex DNA丢失 | 纯化回收率较低 | 重复消化步骤并使用GenElute PCR Clean-up Kit进行纯化，确保使用5倍体积的结合溶液、使用正确体积的乙醇稀释清洗液并在洗脱前适当干燥洗脱柱。 |
| 引物去除酶被核酸酶污染 | 使用新的引物去除酶(SR402)，或者如果无新的分装品可用，购买新的SeqPlex增强型DNA扩增试剂盒(SEQXE) | |
| SeqPlex产物浓度过低，未达到检测方法要求 | 使用特定qPCR引物以及在引物去除前用SeqPlex DNA绘制的标准曲线，估算引物去除后的SeqPlex浓度。注意：模板中包含5’-CTGAAG-3’或5’-CTTCAG-3’的引物在引物去除后不可用于PCR。 | |
| 引物去除前的PCR检查是成功的，但引物去除后的PCR检查失败 | 用于PCR检查的引物扩增的目标序列在引物去除期间被切割 | 选择侧翼区域不含5’-CTGAAG-3’或5’-CTTCAG-3’的PCR引物进行扩增。 |
| SeqPlex DNA在引物去除期间完全降解。 | 参见上文“引物去除后检测到过多（>60%）或全部SeqPlex DNA丢失”部分 | |
| NGS后效果不佳 | SeqPlex起始DNA未切割至200-500bp | 在开始SeqPlex流程之前，根据需要确认起始DNA的大小和片段。 |
| SeqPlex扩增的循环数不足 | 监测扩增循环和并在平台期后继续运行2-3个循环。如果监测完全失败，则可使用默认29个循环。 | |
| NGS IVC 异常 | IVC图显示，多个读取片段中的前几个核苷酸具有相同序列（引物） | 通过对不含SeqPlex DNA的通道进行均一化处理，可实现最佳的仪器簇检出。 |
常问问题解答
- SeqPlex DNA是否可用于基因芯片和qPCR？可以，有或无引物去除的SeqPlex DNA均可用于这些应用，如基因组DNA或现有的GenomePlex产品。
- 如果不需要去除引物，那么SeqPlex比GenomePlex还有哪些优势？SeqPlex预扩增引物比现有GenomePlex WGA引物的靶向性更强，因此对于某些区域具有更高的基因组覆盖度，这是它的优势。
- 减少扩增过程的循环数是否能改善结果？不能，在“平台期”后至少运行2-3个循环，可达到最佳效果。循环不足将导致效果/覆盖度显著降低。
- 如果无法通过实时荧光定量PCR监测扩增循环，那么应该运行多少个循环？当无法通过监测确定最佳循环条件时，建议进行过度循环。对于100 pg-1 ng ChIP样品，24个循环是足够的。对于小于100 pg或质量较差的输入样品，29个循环是足够的。
- 去除引物后剩余的SeqPlex引物是否会干扰下一代测序仪簇检出？不会，含有极少量残余引物的SeqPlex DNA将在Illumina GAIIx和MiSeq仪器上产生优质的序列。为获得最佳的SeqPlex DNA簇检出，请参阅“NGS IVC异常”的故障排除指南。
- SeqPlex引物去除酶是否会去除全部SeqPlex引物？会，SeqPlex引物去除酶可去除完整的引物，但消化可能不是100％完成。
- SeqPlex引物的所有拷贝是否会被完全去除？可能会残留少量的完整SeqPlex引物。大部分SeqPlex DNA(>90%)将完全去除SeqPlex引物。
- 预期得率是多少？得率波动范围很大，取决于多种因素。以100 pg of ChIP DNA为起始物料，预计每个引物去除反应可获得约1-5 ug扩增产物和1-3 µg 可立即用于NGS文库制备的SeqPlex DNA。
注意：预计引物去除将减少多达50%的产物。因此，如果测序需求量大于1 μg，则应进行多次独立的2 μg引物去除反应。
- GenomePlex扩增试剂盒 (WGA3) 是否可与SeqPlex一起使用？不可以，引物去除前后的SeqPlex DNA与GenomePlex再扩增试剂盒不兼容。其引物序列不同。
- SeqPlex DNA是否需要特殊的NGS测序方案？不需要，SeqPlex DNA可直接用于NGS工作流程，就像ChIP DNA一样。应告知测序仪操作人员直接运行SeqPlex DNA，并预期IVC图中将出现残留引物的微弱信号。
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