優化 qPCR 條件
優化 qPCR 條件對於開發穩健的檢測非常重要。優化不佳的表現是重複品之間缺乏重現性，以及檢測效率低且不靈敏。兩種主要方法是優化引物濃度和/或退火溫度。
優化引物濃度的一種方法是建立反應矩陣。
優化引物濃度的一種方法是製作反應矩陣，用來測試每種引物對不同濃度的夥伴引物的濃度範圍。在本方案提供的示例中，演示了一個 6×6 矩陣測試六個濃度（例如，50 nM 到 800 nM）。本方案中所述的數量允許每個條件進行雙重運行。
引物濃度最佳化協議中使用的設備
- 定量 PCR 儀器 用於 PCR 設定的層流罩（選擇性）
試劑
- 合適的檢測模板，例如.g.,cDNA 稀釋 1:10、gDNA 或合成寡核苷酸模板。
- KiCqStart®SYBR® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS00/KCQS00)(KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03-視儀器而定，儀器相容性請參閱 表 P4-6 )。
- PCR級水：PCR級水（W1754 或 W4502），20 mL等分，冷凍；每次反應使用一個新的等分。
- 正向和反向引物濃度儲備（10 μM工作儲備）。
- 定制寡核苷酸可在 sigmaaldrich.com/oligos.
耗材
- 無菌過濾器 吸頭
- 無菌1.5 mL 螺旋蓋微量離心管 (CLS430909)
- PCR 管和板，請選擇符合所需格式的一種：
- 獨立薄壁 200 μL PCR 管 (Z374873 or P3114)
- 孔板
- 96孔板(Z374903)
- 384 孔板(Z374911)
- 板封
- ThermalSeal RTS™ 密封膜 (Z734438)
- ThermalSeal RT2RR™ 薄膜 (Z722553)
本規程的注意事項
- cDNA使用隨機引物或oligo-dT引物方法產生，稀釋1：10，但也可以使用任何合適的替代模板。
- 所有樣品均按照平板布局（圖 P13-18）一式兩份。
圖 P13-18.底物優化板佈局示意圖。
方法
注意： 在總容量為 20 μL 的反應中，每種引物將加入 2.0 μL。因此，引物原液是所需濃度的 10 倍，以達到所需的最終濃度。
1. 使用 10 μM 的引物原液，將兩種引物原液分別稀釋至 0.5、1、2、4、6 和 8 μM，如
Table P13-32.
2. 根據 表 P13-33& 製備 qPCR 母液。nbsp;
(注意： 模板和 cDNA 在步驟 5 中分開加入）。混勻。
*Note: Do not add cDNA and primers until step 5.
3. 移除 184.8 μL (for 12× NTC) master mix from step 2 into a separate tube to use for setting up the
No Template Control (NTC).
4. 在步驟 3 的 NTC 混合物中加入 26.4 μL dH2O（取代模板）。
Note: Set NTC mix on ice for later use.
5. 在步骤 2 剩余的母液中加入 158.4 μL cDNA 模板。將混合母液置於冰上。
6. 加入 2.0 μL 适当的反向引物稀释液到 PCR 板中，按照 图 P13-18; 同时加入
800 nM 浓度到 NTC 行中。
7. 在 NTC 行中加入 2.0 μL of appropriate forward primer dilutions into the PCR plate according to Figure P13-18.
8. Aliquot 16 μL master mix from step 5 into the PCR plate in the wells corresponding to test positions.
9. 将步骤 4 中的 16 μL 混合母液等分到 PCR 板中，用于 NTC 反应。(
11. 按照表P13-34中的两步方案运行样品。步驟 1 和 2 重複進行 40 個循環 ，然後進行解離曲線分析。
注意： 使用標準解離曲線協議（數據收集）。
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