將 NHS 酯修飾與氨基標示的寡核苷酸結合的方案

本方案用於將 NHS 酯修飾，如 TxRd (Sulforhodamine 101-X)（本方案對大多數 NHS 酯修飾有效），鍵合到帶氨基標記的寡核苷酸上，如 5'-Amino-Modifier C6（圖 1）。由於 TxRd (Sulforhodamine 101-X)和其他幾種修飾物僅以 NHS 酯的形式提供，它們必須在合成後的單獨反應中人工接合到氨基標記的寡核苷酸上。

圖 1. 與 TxRd (磺基羅丹明 101-X) 及 5'-Amino-Modifier C6 寡核苷酸進行合成後 NHS 酯修飾反應的範例。

Definitions / Abbreviations

• DMSO - Dimethyl Sulfoxide
• EtOH -乙醇
• HCl - 鹽酸
• NaCl - ；氯化鈉
• NaB - Sodium tetraborate decahydrate (Na₂B₄O_{7 ּ}- 10H₂O)

設備

• 實驗室搖床
• 冷凍離心機 (Eppendorf™ 5810R 或同等設備)
• 冷凍乾燥機或離心蒸發器 (用於非空氣乾燥)/li>

耗材

• 1毫升注射器
• 20號針頭
• 2毫升離心管
• 50 mL 離心管 (選購)
• 移液管吸頭
• 拋棄式移液管
• NaB（產品編號. S9640）
• Milli-Q^® H₂O
• HCl (濃縮)
• 100% EtOH (Product No. E7023-4L），溫度為 -70 °C
• 70% EtOH，溫度為 -20 °C
• 3M 醋酸鈉緩衝液（產品編號. S7899-1L）
• NHS-酯修飾的選擇

方法

共結過程分為兩個主要步驟：

儘管 HPLC 是去除多餘、游離 NHS 酯修飾和未偶合寡核苷酸的傳統方法，但其他純化過程（如沉澱）也可能有效。沉澱法 (如下所述) 可去除大部分但非全部殘留的 NHS 酯修飾。視應用而定，未結合的修飾可能是個問題。由於 NHS-ester 會被緩衝液水解，因此它不會再進一步反應，但它可能會造成背景雜訊，進而導致 S:N 比率變差 (如果修飾是染料，例如 TxRd (Sulforhodamine 101-X))，或降低表面負載密度 (如果修飾的作用是附著，例如生物素)。

共轭反应

从推荐的条件开始，并根据需要进行优化。 

1. 使用前確保所有試劑均已解凍、徹底混合並離心。 
2. 根據 表 1中的指引，將氨基標示的寡核苷酸溶解在結合緩衝液（如 pH 8.5 的 NaB）中。最終寡核苷酸濃度將介於 0.3 和 0.8 mM 之間。請參閱製備 50 mL 0.091 M NaB 緩衝液的附加說明。
3. 將 NHS-ester 改性物溶解於 DMSO 中。NHS-ester 改性物的濃度約為 14 mM（由於改性物的分子量可變，濃度可能有所偏差）。
4. 根據 表 1中的指南，將建議容量的NHS-酯修飾物加到建議容量的氨基標示寡核苷酸中。輕輕攪拌試管。2 mL 管中可容納指定的容量。
5. 在室溫（約 25 °C）下搖動試管 2 小時。適當設定搖床速度，避免液體濺上管壁。為了防止染料光漂白，請用鋁箔覆蓋試管。

表一 連接參考指南。

氨基標示寡核苷酸數量	NaB 結合緩衝液容量	NHS-酯修飾溶液容量	沉澱用EtOH/醋酸鈉容量
200 µL	50 µL	1 mL
>30至60 OD	600 µL	100 µL	2 mL

共轭后沉淀

共轭后沉淀在 2 mL 管（反应规模较大时为 50 mL 管）中进行。

1. 根據表 1 中的指引，將 EtOH / 3M 乙酸鈉 (9:1 V/V) 溶液的體積加入結合反應體積中。渦旋溶液以啟動沉澱。EtOH / 3M 乙酸鈉溶液應使用新鮮的絕對 EtOH 配製（可保存一週）。
2. 在 4 °C 下旋轉試管 20 分鐘。使用 Eppendorf 5810R 型離心機，轉速為 3,000 RPM；使用微離心機，轉速為 13,000 RPM。
3. 加入 500 µL 冷的 70% EtOH (-20 °C)，小心地在試管底部攪拌。
4. 使用步驟 2 中的 RPM 設定在 4 °C 離心 20 分鐘。
5. 使用一次性移液管移除上清液。
6. 如果需要，進行第二次 EtOH 洗滌（步驟 4-6）。
7. 通過空氣、凍乾或離心蒸發乾燥。

寡核苷酸現在已經與修飾物結合在一起，可以溶解在水或緩衝液中，用於預期的應用中。

附加說明

製備 50 mL 0.091 M NaB 緩衝液

1. 將 1.735 g NaB 溶於約 45 mL Milli-Q H₂O 中。
2. 在使用 HCl 調整 pH 至 8.5 之前，讓粉末完全溶解。以 50 μL 的份量加入 HCl 來降低 pH 值。徹底攪拌溶液，然後移取約 25 μL 至 pH 試紙上。
3. 加入 Milli-Q H₂O 直到溶液達到 50 mL。再次渦旋溶液。
4. 取 1 mL 溶液至 2 mL 管中，直至耗盡。

只要 pH 值不高於 8.5（較高的 pH 值會使 NHS-ester 過快水解），就可以用其他非胺緩衝液代替 NaB。

NHS-酯改性物的制备

NHS-酯改性物以无水试剂形式装入瓶中，瓶盖密封。在加入氨基標示的寡核苷酸緩衝溶液之前，請遠離 NHS 酯的濕氣，因為它們會快速水解。使用無水 DMSO 或其他溶劑。

1. NHS-酯修飾物應儲存於 -20 °C。在開瓶之前，請確保其在室溫下完全解凍（請勿加熱）。
2. 在 1 mL 注射器的頂端接上 20 號針頭。使用此注射器抽取所需容量的 DMSO（每 mg NHS-ester 改性固體使用 100 µL；視改性而定，可能需要額外的 DMSO）。使用「氣球」技術將 DMSO 儲存瓶保持在氮壓下，從而防止濕氣進入。
3. 將無水 DMSO 加入 NHS- 酯改性瓶中。用移液管將 DMSO 輕輕地上下移動，同時沖洗瓶子兩側，使粉末溶解。輕輕渦旋瓶身以確保完全溶解。
4. 立即使用改質品（不建議儲存）。