康寧^®球形微孔板

Spheroid Formation Protocol

相較於 2D 格式，體外 3D 細胞培養模型被公認為更符合生理學的系統。為了重現原生腫瘤微環境的特徵，癌細胞可以在 康寧球形微孔板中培養，該微孔板結合了康寧超低附著力表面和創新的孔幾何形狀，為在同一板中生成、培養和檢測三維多細胞球形細胞提供了理想的工具，而無需轉移步驟。

本方案描述了在 96 孔球形微孔板格式中生成和培養腫瘤球的基本方法。此培養和檢測的基本方案可適用於所有球形微孔板。表 2 提供將 96 孔培養容量微型化為 384 孔和 1536 孔格式的建議容量。由於移殖容量和播種密度可能因細胞類型和下游應用而異，因此建議針對特定的檢驗條件進行最佳化。

方法和材料

T-29 人結腸癌細胞培養於 McCoy「s 5a 培養基，A549 人肺癌細胞培養於 F-12K (Kaighn」s Mod.) 培養基，MCF7 人肺癌細胞培養於 F-12K (Kaighn's Mod.) 培養基。) 培養基培養的 A549 人類肺癌細胞，以及 MCF7 人類乳癌細胞。

這些研究使用了在 Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 中培養的 HTB-22™ 和 DU 145 人類前列腺癌細胞。所有生長培養基都含有 10% 的胎牛血清。

球形細胞形成的初始覆蓋密度取決於細胞類型、球形細胞生長階段的持續時間以及評估時所需的球形細胞大小等因素。為了最佳評估球形體的形成和生長，使用 96孔球形體微孔板，在每孔100 µL的生長培養基中，以40、200、1,000、5,000和10,000個細胞的密度培養細胞。使用 CellTiter-Glo^® 3D 細胞存活率分析法分析球狀細胞培養物在 0、24、48 及 72 小時的存活率。

1. 收穫細胞時確保健康的單細胞懸浮液。
   注意：細胞可通過 40 µM細胞過濾器 或帶有細胞過濾器扣蓋的5 mL圓底聚苯乙烯試管來實現單細胞懸浮。
   
   
2. 為每個播種密度準備 5 mL 稀釋液（表 1），以便在每個時間點（4 個 96 孔球形微孔板），每個播種密度播種 8 個孔。

表 1. 播種密度準備

Cell Concentration (cells/mL)	Total Cells (in 5 mL)
0	0	0
40	400	2,000
200	2,000	10,000
1,000	10,000	50,000
5,000	50,000	250,000
10,000	100,000	500,000

3. 將 100 µL 的細胞懸液分佈到每個濃度的八個孔中。對照孔，分配 100 µL 不含細胞的生長培養基。
   
   註：球形微孔板可使用 多道移液器手動**加種，或使用分液儀自動**加種。手動加液對 96 孔和 384 孔球形微孔板都足夠。
   
   *手動加液時，確保移液器吸頭不會刮傷孔底或孔側，以免損壞康寧^®超低附著力表面塗層。
   
   **如果使用自動配液器，請增加稀釋容量，以考慮到儀器的填料和管道長度（10 mL）。
   
   
4. 將球形微孔板置於 37 °C 和 5% CO2 的加濕培養箱中。
   
   
5. 在 0、24、48 和 72 小時的時間點目視評估球形形成和生長，並進行細胞活力檢測。

肉眼觀察

使用倒置顯微鏡進行顯微檢查，並拍攝每個時間點所有五種播種密度的球體，以評估球體的形成和生長。

圖 1. 球體形成與生長

視覺觀察：

在 24 小時時點，細胞形成鬆散聚集的多細胞球體。培養 48 小時後，除了 MCF7 細胞之外，其他細胞都形成了緊實、清晰的球體。72 小時後，HT-29 和 A549 球形細胞以較低的密度（<5,000 cells/well）播種時，大小略有增加，但 48 小時後，DU 145 和 MCF7 球形細胞的大小似乎沒有增加。

細胞存活率測試

CellTiter-Glo^® 3D Cell Viability Assay 協議被遵循。

CellTiter-Glo^® 3D試劑解凍後，讓試劑和檢測板在室溫下放置30分鐘。

CellTiter-Glo^® 3D試劑以1:1稀釋比例直接加入孔中（表2）。使用搖板器搖板 5 分鐘使溶液充分混和，然後在室溫孵育共 30 分鐘。孵育後，使用 EnVision™ Multilabel Plate Reader (PerkinElmer Cat. No. 2104-0010) 讀取發光信號。

註：對於 0 小時時間點（懸浮中的細胞），在讀取信號前，振動平板 2 分鐘，並孵育共 10 分鐘。

表 2. 建議化驗量

	96-well	384-well	30	90	75 - 300	20 - 80	100	50	5
CellTiter-Glo 3D (µL)	100	40*	5
*以與培養基 1:1 的比例加入 CellTiter-Glo 3D 試劑前，先將培養基減少至 40 µL。

Cell Viability Assay:

HT-29和A549球形體呈現持續生長。

觀察到MCF7和DU 145球形體的生長抑制。

大型球體（5,000 和 10,000 初始播種密度）似乎沒有較小尺寸球體所呈現的線性生長。

圖 2. 細胞活力測試

表 3.使用球形微孔板產生的多細胞球體

Cell line	ATCC® Cat.編號	腫瘤類型	中型	球狀形態
BT-474	HTB-20™	人類乳癌/導管癌	RPMI/10% FBS	T
A549	CCL-185™	人類肺癌	F-12K/10%FBS	T
HEK-293	CRL-1573™	人胚胎腎	DMEM/10%FBS	T
5/9m alpha3-18	CRL-10154™	山羊 (CHO-K1 derived), M-CSF production<	DMEM/10%FBS	A
DU 145	HTB-81™	人類前列腺癌	T
IMR-32	CCL-127™	人腦神經母細胞瘤	DMEM/10%FBS	A
Detroit 562	CCL-138™	人咽，SCC	DMEM/10%FBS	T
MCF7	HTB-22™	人類乳腺，腺癌	DMEM/10% FBS<	A
PANC-1	CRL-1469™	人胰腺癌	DMEM/10% FBS	T
HEP G2	HB-8065™	人肝癌	DMEM/10% FBS	A
U-2 OS	HTB-96™	人，骨肉瘤	麥考伊氏5a/10% FBS	T<
HCT 116	CCL-247™	人類結腸癌	麥考伊氏5a/10% FBS	T
HT-29	HTB-38™	人類大腸腺癌	麥考伊氏5a/10% FBS	T
PC-3
PC-3	CRL-1435™	人類前列腺腺癌(IV級)	F-12K/10% FBS	L
MDA-MB-231	HTB-26™	人類乳腺腺癌	L-15/10% FBS	A
T=緊密球形形成 A=細胞聚集形成 L=鬆散細胞聚集形成

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