透過改變蛋白質濃度調節 Corning^® Matrigel^® 和 Collagen I 3D Matrices 的彈性模數

一組複雜的生物物理（如地形、硬度、黏度、孔隙率）和生物化學（如營養、基質成分、細胞與基質之間的互動）提示控制著細胞生物學¹。為了模仿體內細胞行為以了解基礎生物學、組織工程和再生醫學應用，必須更好地闡明和控制這些互動關係。基質彈性的重要性正受到越來越多的研究，自然衍生和工程水凝胶基底的硬度（或彈性模量）已被證明能指導幹細胞分化<²、影響細胞遷移³、調節肌肉收縮力⁴，以及影響細胞擴散和黏附⁵。有趣的是，組織在異常狀態下的硬度也會不同：正常大鼠肝臟組織 (0.3 至 0.6 kPa) 與肝硬化肝臟 (3 至 12 kPa) 相比^6,7，正常乳房組織 (1.2 kPa) 與乳房腫瘤 (2.4 至 4.8 kPa) 相比⁸。這種現象可能是因果關係，而不一定只是疾病狀態的結果⁹。

Section Overview

• Rigidity in Cell Culture
• ECMs的機械性質
結果與討論
<
• 相關產品

細胞培養中的剛性

行系特異性分化的人間充質幹細胞(hMSCs)的系譜特異性分化已被證明會隨著基質硬度的變化而變化，其中hMSCs被定向為特定的表型：神經細胞（基質硬度為 0.1 至 1 kPa）、成肌细胞（8 至 17 kPa）和成骨细胞（25 至 40 kPa）²。隨著交聯聚丙烯酰胺凝膠的硬度增加，細胞的分泌反應（如膠原蛋白 I）也會增加。經過數週的培養後，根據基質的硬度，細胞的特定品系就被確定了。在另一項研究中，肝細胞分化成異常表型（肌成纖維母細胞）是由可溶性因子和基質硬度增加所驅動^6,7。在這種變化之後，產生了更多的異常細胞外基質 (ECM)，導致纖維化（疤痕）。

人前列腺癌腫瘤細胞（DU-145細胞）的遷移速度受到康寧^® Matrigel^®基質硬度增加的影響，在中間硬度³時觀察到最大速度。其他影響遷移速度的因素包括細胞的黏附性和蛋白質分解活性。此外，隨著 Matrigel^® 基質濃度的增加，基質內的孔徑也會減少；然而，這只對遷移速度有輕微影響。

增加Matrigel^®基質濃度（從10%增加到40%）也證實增加了工程骨骼肌構造⁴的收縮力。基質成分對細胞存活和功能的影響極小。

細胞外基質

基底膜是所有組織在體內¹⁰底層的一層薄薄的 ECM 蛋白質。康寧^® Matrigel^®基質是從Engelbreth-Holm-Swarm中提取的溶解基底膜製劑。

（EHS）小鼠肉瘤，是一種富含細胞外基質蛋白的腫瘤，包括Laminin（主要成分）、膠原IV、硫酸肝素蛋白多糖、entactin/nidogen和一些生長因子，這些蛋白在正常的EHS腫瘤中都有^11,12。Matrigel^® 基質已被廣泛應用，例如幹細胞培養、細胞附著和分化、血管生成測試、腫瘤生長和組織工程^13,14。

膠原蛋白是動物體內最豐富的蛋白質，提供結構和機械支撐^15,16。膠原蛋白有許多不同的類型（目前已知約有 28 種）¹⁵，在真皮、肌腱和骨骼中含量最多¹⁴。膠原蛋白的 I 型分子是 300 nm 長的異質三聚體，由兩條 alpha1(I) 鏈和一條 alpha2(I) 鏈組成。

Corning^® Collagen I rat tail 是以酸抽提法¹⁷從大鼠尾腱製備而成。消化時不需要酵素，因此可保留端肽。膠原蛋白可用於薄層促進細胞附著、腫瘤細胞侵襲和移動研究、纖維生成研究、單體細胞或巨 噬細胞的培養和分化，以及肝細胞功能的維持¹⁸。膠原蛋白 I 也可用於 3D 凝膠形式或電紡成膜，以支援 3D 細胞生長和分化¹⁴。

ECM 的機械特性

材料的機械特性（如硬度或彈性模量）可使用多種技術測量，如體積抗壓/抗張測試、流變儀、動態光散射、原子力顯微鏡 (AFM) 和奈米壓痕^19,20。

在旋轉或動態流變儀中，黏彈性材料的特性是透過在樣品上施加振盪剪切應變來量測，最常見的是在平行板設定下執行。舉例來說，在一項研究中，使用平行板流變儀測試不同濃度的 Corning^® Matrigel^®基質（標準產品），濃度範圍從 50% 到 100% 不等，剛度 (G') 從大約 10 線性增加到 50 Pa²²。在另一份報告中，使用應力控制流變儀對 Matrigel^®基質（高濃度產品）濃度分別為 4.4、8 和 17 mg/mL 測得的儲存模量分別約為 20、70 和 300 Pa²¹。有報告指出 Matrigel^® 基質 (高濃度產品)的硬度值為 44 Pa²²。同樣地，有幾本刊物也報告了膠原蛋白 I 凝膠的硬度值。使用旋轉流變儀時，據報告膠原蛋白 I (大鼠尾部，2 mg/mL)的硬度為 9 Pa²³。此外，當膠原蛋白 I 與 Matrigel^® 基質以 2 或 4 mg/mL 的濃度混合時，硬度分別增加到 13.4 Pa 和 40.7 Pa。

當使用壓縮力取代剪切力時，也會觀察到不同的機械反應。使用位移控制非緊密壓縮測試方法，膠原蛋白 I (2 mg/mL) 樣品的模量達到 6 kPa²⁵。當加入 Matrigel^® 基質 (10% 至 50% 的添加量) 時，結構變得越來越硬，模量範圍可達 10 kPa。

本研究獲得的值比旋轉流變研究的值高出幾個數量級。

使用 AFM 壓痕法將尖銳的尖端壓入樣品，可以測量局部的機械特性。在生理條件下（37°C 和水溶液），使用微米大小的球形尖頭以 AFM 測量 Matrigel^® 基礎（標準產品）的平均彈性模量為 443 Pa²⁶。流變學與 AFM 量測的硬度結果不同，可能是由於兩種方法的長度尺度（體積與表面）不同所致。

應該注意的是，大部分的細胞培養工作通常是在 2D 基材上進行，這些基材是由玻璃和聚苯乙烯等硬質材料製成，有時還會塗上一層薄薄的 ECM。例如，聚苯乙烯和玻璃基板的硬度值在 GPa 範圍內，比 ECM 蛋白質 (Pa 至 kPa 範圍內) 的硬度值高出數個數量級，導致細胞出現非自然行為¹。

在本文中，我們研究了 Matrigel^® 基質和膠原蛋白 I 凝膠的彈性模數與蛋白濃度的關係。流變測量是在旋轉流變儀上使用單頻溫度掃描進行的。

Materials and Methods

Corning^® Matrigel®

康寧^® Matrigel^®基質，生長因子還原（Matrigel^® GFR, Corning^® Product No.354230) 和 Corning^® Matrigel^®matrix High Concentration, Growth Factor Reduced (Matrigel^® HC GFR, Corning^® Product No.354263），按照使用指南^27-29的指示在冰中解凍過夜。使用冰冷的 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)，將 Matrigel^® 矩陣產品稀釋至所需的蛋白質濃度，蛋白質濃度以分析證書上提供的批次特定蛋白質濃度為準。用移液管上下移動混和小瓶中的內容物，然後用正排量移液管移取計算出的Matrigel^®基質用量，以確保準確性，並加入冰冷的DMEM中，放入預先冷凍的玻璃管中，用冰保存。稀釋後的樣品輕輕攪拌並置於冰中。由於 Matrigel^® 基質的聚合與溫度有關，且不可逆轉，因此必須在冰中準備和保存樣品。稀釋後的 Matrigel^® 基質樣品在使用正排量移液管 (0.680 mL) 將測試樣品載入流變儀之前，立即倒置混合。每種蛋白質濃度測量三次。

使用 Matrigel^® HC GFR 製作濃度為 3、6、9 和 15 mg/mL 的樣品。使用 Matrigel^® GFR 製作濃度為 9 mg/mL 的樣品。所需的 Matrigel^® 基質和冰冷 DMEM 稀釋液的體積計算如下：

Desired final volume (mL) x Desired protein concentration (mg/mL)	= Matrigel® ；基質所需的體積 (mL)
Lot-specific protein concentration (mg/mL)<

期望的最終體積 (mL) - 所需的 Matrigel^® 基質體積 (mL) = 所需的冰冷稀釋液體積 (mL)

例如，使用康寧^® Matrigel^®基質 HC GFR 製備 10 mL 溶液，蛋白質濃度為 9 mg/mL，釋放的蛋白質濃度為 19.1 mg/mL:

10 mL x 9 mg/mL	= 4.7 mL
19.1 mg/mL

例如，使用 Matrigel^® GFR 释放的蛋白浓度为 9.5 mg/mL:

5 mL x 9 mg/mL	= 4.74 mL
9.5 mg/mL

Collagen I Preparation

Corning^® Collagen I High Concentration, rat tail (Collagen HC rat tail, Corning^® Product No.354249）凝膠化是pH 和溫度依賴的，產品必須中和才能聚合。膠原蛋白 HC 大鼠尾部稀釋時，使用特定批次分析證書^30,31中的交替凝膠化程序。

為製備所需容量和蛋白濃度的膠原蛋白 I 溶液，每毫升膠原蛋白 I 加入 0.1 倍的 10X Dulbecco's 磷 酸鹽緩衝生理鹽水 (10X DPBS, Thermo Fisher)、0.023 毫升的 1N 氫氧化鈉 (JT Baker)，並使用冰冷去離子水調整最終容量。攪拌試管內容物，使用正排量移液管將所需容積的膠原蛋白 I 加入溶液中，輕輕攪拌並置於冰上。在使用正排量移液管（0.680 mL）將測試樣品載入流變儀之前，立即將所有稀釋後的樣品倒置混勻。

使用 Collagen HC rat tail 製作濃度為 1、3 和 7 mg/mL 的樣品。

例如，使用 Collagen HC rat tail（批號：7016285）製作 6 mL 溶液，最終膠原蛋白 I 濃度為 7 mg/mL，蛋白質濃度為 1 mg/mL。

將 0.6 mL 的 10X DPBS、0.0984 mL 的 1N NaOH 和 1.02 mL 的冰冷去離子水加入預先冷凍的玻璃管中，攪拌混合。使用正排量移液管將 4.28 mL 的膠原蛋白 HC 大鼠尾部加入玻璃管中。

流變測量

樣品使用 Kinexus^® Ultra+ 旋轉流變儀 (Malvern Instruments) 分析，使用平行板 (40 mm 粗糙化) 配置。在 5°C 的溫度下，使用正排量移液管將樣品 (0.680 mL) 直接加入下層平板的中央。在凝膠開始形成之前，立即降低頂板的溫度，使工作間隙達到 0.5 mm。溫度以每分鐘 10°C 的速度從 5°C 遞升至 37°C，並將溫度保持在 37°C。使用溶劑捕捉器覆蓋樣品，防止周圍的蒸發效應。以 0.5 Hz 的單一頻率和 0.2% 的應變定期進行黏彈性測量。測量記錄直到彈性模數達到平衡為止。

成功使用 Corning^® Matrigel^® Matrix

儲存

• 儲存於 -20°C 無霜冷藏室。
• 盡量減少溫度波動，請勿存放在門上或經常打開的冷藏室內。

解凍

• 包裝在冰塊中（完全浸入）。
• 蓋上冰桶，放置在 2°C 至 8°C 的地方（冷藏室或冰箱）過夜。
• 避免重複凍融週期。
• 使用相同的指引解凍一次性使用的等分物，時間可根據等分物的體積調整。

稀釋

• 使用分析證書上提供的特定批次蛋白濃度製備稀釋液。
• 將 Matrigel^® 基質和所有溶液保持在冰上。
• 將 Matrigel^® 基質加入冰冷的溶液中（請勿用水稀釋，可能會形成聚集體）。

處理

• 提前計劃。
• 適當解凍 Matrigel^® 基質。
• 解凍小瓶後立即準備 Matrigel^®基質等分。
• 使用相同的建議儲存條件儲存一次性使用的等分。
• 僅取未稀釋的 Matrigel^® 基質。
• Matrigel^® 基質對溫度敏感，超過 10°C 將開始凝膠化。

成功使用康寧^®膠合劑的小訣竅。sup>® Collagen I, Rat Tail

儲存

• 儲存於 2°C 至 8°C。
• 請勿冷凍本產品。

稀釋

• 使用分析證書上提供的批次特定蛋白濃度製備稀釋液。
• 使用冰冷的溶液。
• 將產品和稀釋後的樣品保存在冰上。
• 使用正排量移液管準確移液（由於粘度）。

處理

• 聚合與 pH 值和溫度有關。

結果與討論

存在於天然衍生 ECM（例如康寧^® Matrigel^® 基質和膠原蛋白 I 自組成複雜的 3D 纖維結構³²。這些基質的機械特性可調節無數的細胞功能，包括細胞擴散、增殖、遷移和分化¹¹。材料的機械特性（如硬度或彈性模量）可使用多種技術進行測量，如體積抗壓/抗張測試、流變儀、AFM 和奈米壓痕。

為了研究改變蛋白質濃度是否會改變 Matrigel^® 矩陣凝膠的彈性模數，Corning^® Matrigel^® High Concentration, Growth Factor Reduced (Matrigel^® HC GFR; at a concentration of 19.1 mg/mL）使用冰冷的 DMEM 稀釋，液體樣品直接加入旋轉流變儀中。底板溫度（Peltier 控制）從 5°C 遞升至 37°C，然後維持在 37°C，這是 Matrigel^® 基質的建議凝膠化溫度。

觀察複合剪切模量的彈性分量（G'）和黏性分量（G"）隨時間的演變，並讓樣品達到平衡狀態。在 Matrigel^® HC GFR 的 3 到 19.1 mg/mL 的濃度範圍內，剪切模量的彈性分量從 9.1 ± 0.3 Pa 增加到 288.2 ± 9 Pa（圖 1A 和 1B）。在平衡狀態下，彈性分量的高原值大於粘性分量，表明最終形成的凝膠具有彈性（圖 1C）。

圖 1. 彈性模數的增加與 Corning^® Matrigel^® HC GFR 濃度的關係。 (A) 不同濃度 Matrigel^® 基質樣品的彈性模數 (G') 與時間的關係圖。溫度從 5°C 遞升至 37°C，並保持在 37°C。(B) Matrigel^® 基質濃度（n = 3）的 G' (Pa) 高點值。(C) Matrigel^® 基質濃度為 15 mg/mL 時，彈性模量和黏性模量的代表性時間過程。

康寧^® Matrigel^®基質提供濃度範圍為18至22 mg/mL的Matrigel^® HC GFR（高濃度產品）和濃度範圍為7至10 mg/mL的Corning^® Matrigel^® Growth Factor Reduced (Matrigel^® GFR)，濃度範圍為 7 至 10 mg/mL。測量了在相同蛋白質濃度（9 mg/mL）下使用 Matrigel^® HC GFR 和 Matrigel^® GFR 形成的凝膠的剪切模量（彈性成分），發現它們具有可比性（圖2），顯示Matrigel^®基質的機械特性不會受到高濃度和標準濃度產品加工過程中微小差異的影響。

圖 2. 在相同蛋白濃度（9 mg/mL）下形成的兩種不同Corning^® Matrigel^®基質產品的彈性模量（G'）比較。 (A) Matrigel^® HC GFR 和 Matrigel^® GFR 樣品的彈性模量與時間的關係圖。溫度從 5°C 遞升至 37°C，並保持在 37°C。(B) 兩種不同 Matrigel^® 基質產品 (n = 3) 的 G' (Pa) 高點值。

為了研究改變蛋白質濃度是否會改變膠原蛋白I凝膠的彈性模量，我們用1 N NaOH溶液中和Corning^®膠原蛋白I高濃度鼠尾（Collagen HC rat tail；濃度為9.82 mg/mL），製作不同濃度的樣品。對於膠原蛋白 HC 大鼠尾部濃度為 1、3 和 7 mg/mL，G' 分別穩定在 5.0 ± 0.6 Pa、55.4 ± 11.0 Pa 和 341.8 ± 32.4 Pa（圖 3A 和 3B）。膠原蛋白 I 凝膠的彈性行為與 Matrigel^® 基質凝膠相似，當比較 G' 和 G" 的高原值時可以看出 (圖 3C)。

在凝膠形成過程中起重要作用並影響模量的其他因素包括凝膠化溫度、溫度斜坡、蛋白質溶液的一般處理變化，以及更明顯的膠原蛋白 I 溶液的 pH 值。流變儀的參數，例如施加的剪切力、頻率、工作間隙，以及用於測量的儀器類型，都可能影響最終獲得的模量值。

圖 3. 彈性模量增加與膠原蛋白 HC 大鼠尾部濃度的關係 (A) 不同濃度膠原蛋白 I 樣品的彈性模量 (G') 隨時間變化的繪圖。溫度從 5°C 遞增至 37°C，並保持在 37°C。(B) 膠原蛋白 I 濃度 (n = 3) 與剪切模量 (彈性分量，G') (Pa) 的高原值。(C) 濃度為 7 mg/mL 的膠原蛋白 I 的彈性模量和黏性模量的代表性時間過程。

結論

細胞行為受各種物理化學因素的複雜相互作用所支配。舉例來說，基底的機械特性對細胞功能的影響，對於了解細胞生物學，以及在細胞治療和再生醫學的應用上，仍是一個激烈研究的領域。目前已有許多高靈敏度的工具與技術可用於量測基材的機械特性。在本文中，我們使用旋轉流變儀來研究蛋白質濃度對康寧^® Matrigel^®基質和膠原蛋白I凝膠彈性模數的影響。觀察到兩種材料的彈性模數都隨著蛋白質濃度的增加而增加，凝膠具有彈性。

鳴謝

我們感謝Dr.Philip Rolfe 和 Maria Lightfoot (Malvern Instruments, Westborough, MA) 讓我們使用 Kinexus^® Ultra+ 流變儀，並協助設定、資料收集和分析。

參考文獻

1-20

參考資料

1. Santos, E. et al. Cell-biomaterial interaction: Strategies to mimic the extracellular matrix. Chapter 25, on biomimetics, Pramatarova L. (Ed.), InTech (2011).

2. Engler, A. J. et al. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell, 126, 677-689 (2006).

3. Zaman, M. H. et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of National Academy of Sciences USA, 103(37) (2006).

4. Hinds, S. et al. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials, 32, 3575-3583 (2011).

5. Pelham, Jr R. J. and Wang Y-L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility, Proceedings of National Academy of Sciences USA, 94, 13661-13665, (1997).

6. Olsen, A. L. et al. Hepatic stellate cells require a stiff environment for myofibroblastic differentiation, American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology, 301, G110-G118 (2011).

7. Li, Z. et al. Transforming growth factor-and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture, wells. Hepatology, 46(4), 1246-1256 (2007).

8. Keely, P. and Nain, A. Capturing relevant extracellular matrices for investigating cell migration. F1000Research, 4 (F1000 Faculty Rev), 1408 (2005).

9. Liu, F. et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. Journal of Cell Biology, 190(4), 693-706 (2010).

10. LeBleu, V. S. et al. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine, 232(9), 1121-1129 (2009).

11. Kleinman, H. K. et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry, 21, 6188 (1982).

12. Kleinman, H. K. et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry, 25, 312 (1986).

13. Kleinman, H. K and Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology, 378-386 (2005).

14. Sanyal, S. Culture and assay systems used for 3D cell culture. Corning CLS-AC-AN-245.

15. Shoulders, M. D. and Raines, R. T. Collagen structure and stability. Annual Review of Biochemistry, 78, 929-958 (2009).

16. Muiznieks, L. D. and Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta- Molecular Basis of Disease, 1832, 866-875 (2013).

17. Artym, V. V. and Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology, 48:10.18, 10.18.1-10.18.20 (2010).

18. Cheema, U. et al. Collagen: Applications of a natural polymer in regenerative medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering - Cells and Biomaterials, Eberli D. (Ed.), InTech (2011).

19. Vinckier, A. and Semenza, G. Measuring elasticity of biological materials by atomic force microscopy. FEBS Letters, 430(1-2), 12-16 (1998).

20. McKee, C. T. et al. Indentation versus tensile measurements of Young’s modulus for soft biological tissues. Tissue Engineering Part B, 17(3), 155-164 (2011).

21-32

21. Chaudhuri, O. et al. Extracellular matrix stiffness and composition jointly regulate the induction of malignant phenotypes in mammary epithelium. Nature Materials, 13, 970-978 (2014).

22. Lambricht, L. et al. The type and composition of alginate and hyaluronic-based hydrogels influence the viability of stem cells of the apical papilla. Dental Materials, 30(12):e349-61 (2014).

23. Anguiano, M. et al. Characterization of three-dimensional cancer cell migration in mixed collagen-Matrigel scaffolds using microfluidics and image analysis. PLoS ONE, 12(2): e0171417 (2017).

24. Motte, S. and Kaufman, L. J. Strain stiffening in Collagen-I networks, Biopolymers, 99(1), 35-46 (2012).

25. Dewitt, D. D. et al. Collagen I-Matrigel scaffolds for enhanced schwann cell survival and control of three-dimensional cell morphology. Tissue Engineering Part A, 15(10), 2785-2793 (2009).

26. Soofi, S. S., et al. The elastic modulus of Matrigel as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology, 167(3), 216-219 (2009).

27. Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 10 mL; Guidelines for Use (SPC-354230).

28. Corning Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration Growth Factor Reduced, 10 mL; Guidelines for Use (SPC-354263).

29. Corning Matrigel Matrix Frequently Asked Questions (CLS-DL-CC-026).

30. Corning Collagen I High Concentration (HC), Rat Tail; Certificate of Analysis (SPC-354249).

31. Corning Collagen Products Frequently Asked Questions (CLS-DL-AC-004).

32. Trappmann, B. and Chen, C. How cells sense extracellular matrix stiffness: a material’s perspective. Current Opinion in Biotechnology, 24(5), 948-953 (2013).