Corning® Matrigel®基底膜基質是從Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)小鼠腫瘤中提取的可溶性基底膜，在室溫下凝膠形成真正的重組基底膜。Corning Matrigel 基質的主要成分為層蛋白 (~60%)、膠原蛋白 IV (~30%)、entactin (~8%) 及硫酸肝素蛋白多糖。康寧 Matrigel 基質中也有生長因子、膠原蛋白酶、纖維蛋白原活化劑和其他未定義成分的報告。
試劑與材料
- MDCK細胞株
- 康寧 Matrigel 基質
- MEM
- FBS
- PBS
- 0.25% Trypsin/EDTA
- 24 孔板
方案 1.MDCK 3D 頂層培養
1.使用前將小瓶浸入 4 °C冰箱解凍 Matrigel 基質過夜。
2.在預冷的 24 孔板的每個孔中加入 200 μL Matrigel 基質（8 至 11 mg/mL），用移液器吸頭均勻塗抹，然後在 37 ℃ 培養 30 分鐘。
注意：所有與 Matrigel 基質接觸的培養皿或培養基都應預先冷凍/冰鎮。
注意：所有與Matrigel基質接觸的培養皿或培養基都應該是預先冷凍/冰冷的。在整個過程中保持Matrigel基質在冰上，在凝膠過程中不要過度乾燥Matrigel基質。注意：使用健康且不超過 85% 匯合的細胞。
3.用 MDCK 完全培养基（MEM + 10% FBS）重新悬浮细胞，将最终细胞密度调整为 3 x 105 cells/mL，将 250 μL制备好的细胞悬浮液装入预涂布的 24 孔板的每个孔中，然后在 37 °C 下培养 30 分钟。
注意：細胞數量可能需要根據細胞系的生長特性進行優化。
5.在冰上冷凍 MDCK 完全培養基，加入 Matrigel 基質至最終容量的 10%（最終濃度：0.8 至 1.1 mg/mL）。
注意：在加入Matrigel基質前，必須徹底冷凍培養基，以確保均勻混合和Matrigel基質均勻地沉積在培養物細胞上。用移液管將 Matrigel 基質培養基混合物從孔的一側移下，以避免擾亂細胞或 Matrigel 基質。
6.持續培養 4 到 7 天，每 2 天更換一次 Matrigel 基質培養基混合物.
7.建議對 3D 培養物進行免疫染色，並使用共聚焦顯微鏡觀察細胞形態。
方案 2.嵌入式 MDCK 3D 培養
1. 使用前將康寧® Matrigel®基底膜基質的小瓶浸入 4 °C冰箱的冰中解凍過夜。
2.在第 0 天，用冰冷的 MDCK 完全細胞培養基（MEM + 10% FBS）稀釋 Matrigel 基質至 5 mg/mL。
注意：
注意：在整個操作過程中，所有與Matrigel基質接觸的培養皿和試劑都要保持冰冷。
3.使用預先冷凍的吸頭，在預先冷凍的24孔板中，每孔加入100 μL的Matrigel基質（5 mg/mL），用吸頭均勻塗抹，37 °C孵育30分鐘，形成凝膠。
注意：在凝膠過程中，不要過度乾燥 Matrigel 基質。
4.胰酶解單層 MDCK 細胞，使其成為單細胞懸浮液，然後在室溫（RT）下以 125 x g 離心 5 分鐘，使細胞沉澱。
注意：使用健康且不超過 85% 匯合的細胞。MDCK細胞傾向於形成細胞團，因此，通常需要用力移動它們以獲得單個細胞懸浮液.
5.用 MDCK 完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞密度至 5 × 106 cells/mL。將 30 μL 製備好的細胞懸液加入 270 μL Matrigel 基質溶液（5 mg/mL）中，冰鎮保存，最終細胞密度為 5 x 105 cells/mL。
注意：細胞的體積不應超過 Matrigel 溶液的 10%，以確保稀釋的 Matrigel 溶液能正常聚合成基質。根據細胞株的生長特性，細胞數量可能需要優化。
6.在每孔中輕輕加入 500 μL MDCK 完全培養基。保持培養 8 到 10 天，每 2 天更換一次培養基.
8.建議對 3D 培養物進行免疫染色，並使用共聚焦顯微鏡觀察細胞形態.
9.
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參考資料
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