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首頁3D 細胞培養癌症幹細胞腫瘤球形成程序

癌症幹細胞腫瘤球形成程序

實體腫瘤以三維（3D）空間構形生長，導致對氧氣和營養物以及其他物理和化學壓力的異質暴露。為了模擬三維空間構造，3D 體外培養模型 已用於癌症研究。 癌症幹細胞 (CSCs)被定義為腫瘤內具有自我更新能力的一小部分細胞，常驅動腫瘤的進展和化療後的復發。傳統上，癌症幹細胞是從癌症細胞系和腫瘤活組織中分離出來，並在三維腫瘤球懸浮培養物中培養。

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腫瘤球形成程序概述

展開以瞭解更多協定細節。

使用胰蛋白酶分離細胞

顆粒電池

    以 1x104 cells/ml 種植細胞

    。

      在低附著板中

        將球體轉移到 15 毫升的試管中

        。

          Aspirate Media 離開球體

            用 1X PBS 洗滌球基

            。

              加入 1 毫升胰蛋白酶 2-4 分鐘

              。

                使用移液管攪拌 10-20 次，將球體打散

                。

                  種植細胞為 1X104 cells/ml

                    腫瘤球形成試驗

                    1. 使用胰蛋白酶-EDTA溶液（T3924）將含有癌幹細胞的黏附生長癌細胞系的細胞脫離。
                    2. 將細胞懸浮液以 300 x g 離心 5 分鐘，並吸出上清液。將細胞重悬於小容量（例如 3-5 mL）的 3dGRO™ Spheroid Medium (S3077)中。
                    3. 點算細胞 (PHCC360KIT)，並使用 3dGRO™ Spheroid Medium 調整容量，以獲得 1X106 cells/mL 的濃度。
                    4. 以 1X104 cells/mL 將細胞播種於適當的懸浮培養容器中，例如40,000 cells in 4 ml of 3dGRO™ Spheroid Medium in each well of a Corning® Costar® Ultra-Low attachment multiwell plate (CLS3471)。
                    5. 培養 4-10 天，視使用的細胞類型而定。每 3-4 天加入二分之一培養容量的新鮮 3dGRO™ Spheroid Medium。
                    6. 在腫瘤球開始形成暗中心之前進行傳代。
                    7. 使用血清移液管將細胞和培養基移入 15 mL 錐形試管，收集腫瘤球。
                    8. 在室溫下讓腫瘤球重力沉降 10 分鐘。吸出上清液，但在圓錐管中留下約 200 μL。
                    9. 用等容量的 PBS（D8662）重複步驟 7-8。
                    10. 將 1 mL 胰蛋白酶-EDTA (T3924)溶液加入腫瘤球，在室溫下培養 2-4 分鐘。每 30 秒上下移液一次，以保持球體重懸於胰蛋白酶溶液中。
                      注意：達到完全解離所需的最佳孵育時間必須由使用者根據每種細胞類型的經驗來決定。雖然在大多數情況下 2-3 分鐘是最佳時間，但某些細胞類型的腫瘤球，例如 MCF-7，可能需要較長的孵育時間，尤其是在較高的傳代。
                    11. 使用 1000 μL 移液器吸頭上下移動球體 10-20 次，以產生單個細胞懸浮液。如常吸出細胞懸浮液，但在排出細胞時將移液管吸頭稍微傾斜於管子底部。所產生的剪切力有助於破碎任何殘留的細胞聚集體。進行目視檢查，確認沒有大的細胞聚集物殘留。
                      注意：請勿過度濃縮，否則會影響細胞活力。將細胞懸浮液通過 40 μM 的細胞過濾器，可去除未分離的細胞聚集。
                    12. 確定細胞數量和活力。將細胞以 300 x g 離心 5 分鐘。棄掉上清液，以 1X106 cells/ml 將細胞重悬於新鮮的 3dGRO™ Spheroid Medium 中。
                    13. 將細胞以 1X104 cells/ml 混種於新的康寧® Costar® Ultra-Low attachment multiwell plate (CLS3471)。通常使用 6 孔板，每孔 4 mL 培養基，每孔 4X104 個細胞。

                    典型結果

                    圖 2 MCF

                    圖 1. 在 3dGRO™ Spheroid Medium 中培養的 MCF7 乳癌細胞在第 1 階段 (A) 和第 5 階段 (B) 的腫瘤球形成。

                    E006AA 的氣墊層形成

                    圖 2.在 3dGRO™ Spheroid Medium 中培養的 E006AA 前列腺癌細胞在第 1 階段 (A) 和第 5 階段 (B) 的腫瘤球形成。

                    小技巧

                    有些細胞（例如 E3006AA 細胞）在最初的幾次傳代中會出現生長抑制或附著在 3D 培養板上的現象，但是它們會適應 3D 培養，並在大約 3sup> 年後再增殖。有些細胞（例如 E3006AA 細胞）在最初的幾次培養中會出現生長抑制或附著在 3D 培養板上，但是它們會適應 3D 培養，並在第 3rd passage 後再次增殖。

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