Cultrex^® 3-D Culture Matrix™ 大鼠膠原蛋白 I 規範

Product No. 3447-020-01

I.產品說明

3-D Culture 是一種創新的方法，用來模擬早期腫瘤發生對三維微環境的形態影響。健康時，分化的細胞會呈現結構化、極化的形態，這對細胞的形成和功能至關重要。在癌細胞發育過程中，與細胞發育、增殖和死亡相關的細胞週期控制會消失，因此這些結構會被破壞。實際上，這些結構的形態可以作為研究早期癌症發展因素的量度。在標準化的嘗試中，J. Debnath, et al.發表了以 MCF-10A 乳腺上皮細胞為模型執行此分析的指引。¹ Cultrex^® 3-D Culture Matrix™ 產品線提供專門用於3-D培養研究且合格的試劑。

I型膠原蛋白是結締組織和內臟中細胞外基質的主要結構成分，但在真皮、肌腱和骨骼中最為普遍。它是一種 300 kDa 的分子，由兩條 alpha1(I) 鏈和一條 alpha2(I) 鏈組成，在中性 pH 值和 37 °C 下可自發形成三重螺旋支架。這種現象可被利用來促進細胞在發育過程中的附著、生長、分化、遷移及組織形態的形成。為了提供最標準的膠原蛋白 I 供 3-D 培養使用，我們採用特殊的製程來提供標準濃度約 5 mg/mL 的材料。然後將此材料加入 3-D 培養以驗證功效。規格

1. 濃度：I 型膠原蛋白的濃度為 5 mg/mL（Sircol 分析）
2. 來源：大鼠尾腱
3. 儲存緩衝液：20 mM 醋酸

III.需要但未提供的試劑和設備

1. 設備
   1. 層流罩
   2. 37 °C CO₂ 培養箱
2. 試劑
   1. 感興趣的細胞株
   2. 細胞採集緩衝液；EDTA、胰蛋白酶或其他細胞脫離緩衝液
   3. 組織培養生長培養基
   4. 必要時加入培養基的藥劑
   5. 無菌磷酸緩衝生理鹽水 (PBS) (Product No. P5493)清洗細胞
   6. 無菌 1N NaOH  (Product No. S2770）
   7. 無菌 7.5% 碳酸氫鈉 (產品編號 S8761)
   8. 無菌蒸餾水 (產品編號. W3513）

IV.注意事項與限制

1. 僅供研究使用。
2. 這些產品的物理、化學和毒理特性可能尚未完全研究清楚；因此，我們建議在使用這些化學試劑時，應戴上手套、穿著白大褂並戴上眼睛保護套。

V.材料資格

1. 功能測試
   1. 細胞附著 - 測試其促進 HT-1080 人類纖維肉瘤細胞附著和擴散的能力。
   2. 三維培養 - Collagen I 可促進鼠內皮 SVEC4-10 細胞的附著與生長。
2. 無菌測試
   1. 在USP XXIV第71章無菌測試後，於37 °C培養14天後，未檢測到細菌或真菌生長
3. 膠凝
   1. I 型膠原蛋白在中性 pH 和 37 °C 下形成堅硬的凝膠，當稀釋至 0.4 mg/mL.

VI.儲存與穩定性

本產品若儲存於 4 °C，其穩定性至少可維持 3 個月。

膠凝規程 I

1. 為防止污染，整個過程中請在層流生物艙中保持無菌技術。使用預先冷凍於 4 °C 的溶液，並將溶液保持在冰上，可延長膠原蛋白 I 中和後保持在溶液中的時間。
2. 將下列物質置於冰上：
   1. I型膠原蛋白（5 mg/mL）
   2. 無菌10倍PBS
   3. 無菌蒸餾水
3. 確定實驗所需的膠原蛋白濃度和最終體積。
4. 確定所需試劑的用量，以便膠原蛋白 I 在 1N NaOH 中和的 1X 磷鹽緩衝生理鹽水 (PBS) 中達到所需的濃度：

(Final Conc.膠原蛋白的最終濃度）*（總體積）
	(Initial Conc.

(Total Volume)
	10

4. 在無菌試管中混和 10X PBS、1N NaOH 和 dH₂O。
5. 將膠原蛋白 I 加入試管中，用移液管上下攪拌（不要渦旋）。溶液在冰上可穩定達一小時。平板可在 4 °C 下 300 x g 離心 10 分鐘，以防止凝膠中形成氣泡。
6. 在 37 °C 下孵育平板 1 小時，以促進凝膠形成。

VIII.凝膠化程序 II

對於某些細胞類型，使用 7.5% (w/v) 碳酸氫鈉中和的凝膠化程序可能較為可取。

1. 將下列物質置於冰上：
   1. I型膠原蛋白（5 mg/mL）
   2. 無菌10X PBS
   3. 無菌蒸餾水
   4. 無菌、7.5%碳酸氫鈉
2. 確定實驗所需的膠原蛋白濃度和最終體積
3. 確定所需試劑的量，使膠原蛋白I在7.5%碳酸氫鈉中和的1X磷酸緩衝生理鹽水（PBS）中達到所需的濃度。

(Final Conc.(膠原蛋白的最終濃度)*(總體積)
	(膠原蛋白的初始濃度)

(Total Volume)
	10

•  
  3. 需要 7.5% 碳酸氫鈉的體積 = (膠原蛋白的體積，步驟 a) X 0.0125 mL
  4. 需要蒸餾水的體積 = 總體積 - (步驟 a+b+c 的體積總和)

 

4. 在無菌試管中混合 10X PBS、dH₂O 和 7.5% 碳酸氫鈉。
5. 將膠原蛋白 I 加入管中，用移液管上下攪拌（不要渦旋）。
6. 將中和的膠原蛋白 I 溶液放入所需的平板或平皿中。此溶液在冰上可穩定 1 小時。平板可在 4 ⁰C 下 300 x g 離心 10 分鐘，以防止凝膠中形成氣泡。
7. 在 37 ⁰C 下培養 1 小時，以促進凝膠形成。

IX.高濃度膠原蛋白凝膠製程

1. 將膠原蛋白 I (5 mg/mL)、7.5% 碳酸氫鈉溶液、無菌試管和細胞培養板置於冰上。
2. 每0.1 mL膠原蛋白I（5 mg/mL）加入5 μL的7.5%碳酸氫鈉溶液。
3. 用移液管上下移動膠原蛋白I進行混合（不要攪拌）。板可在 4 ⁰C 下以 300 x g 離心 10 分鐘，以防止凝膠中形成氣泡。
4. 將板在 37 ⁰C 下培養 1 小時，以促進凝膠形成。

在3-D Culture Matrix™ Collagen I上培養的乳腺上皮細胞MCF-10A在添加3-D Culture Matrix™ Laminin-1後被誘導分化：a) 0 mg/mL，b) 1 mg/mL，c) 2 mg/mL。

法律資訊

3-D Culture Matrix 是 Trevigen, Inc.

參考資料

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5. Kuznetsova N, Leikin S. 1999. Does the Triple Helical Domain of Type I Collagen Encode Molecular Recognition and Fiber Assembly while Telopeptides Serve as Catalytic Domains?. J. Biol. Chem.. 274(51):36083-36088. https://doi.org/10.1074/jbc.274.51.36083

6. Leikin S, Rau DC, Parsegian VA. 1994. Direct measurement of forces between self-assembled proteins: temperature-dependent exponential forces between collagen triple helices.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(1):276-280. https://doi.org/10.1073/pnas.91.1.276

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