Rozwiązywanie problemów podczas klonowania molekularnego

Przegląd klonowania molekularnego

Klonowanie molekularne służy do składania rekombinowanych cząsteczek DNA i kierowania ich replikacją w organizmach gospodarzy, tworząc wiele cząsteczek DNA. Klonowanie obejmuje replikację jednej cząsteczki w celu wytworzenia populacji komórek o identycznych cząsteczkach DNA. Jest ono powszechnie stosowane do amplifikacji fragmentów DNA zawierających całe geny lub dowolne sekwencje DNA (takie jak promotory, sekwencje niekodujące i losowo pofragmentowane DNA). Klonowanie molekularne jest procesem wstawiania genu zainteresowania (GOI) do wektora plazmidowego, a ten wektor jest następnie wstawiany do komórki, która wyraża białko kodowane przez GOI. Po ekspresji białka w komórce, ekspresja białka może być wykorzystana do różnych badań (takich jak sygnalizacja komórkowa, morfologia lub inne aspekty).

Klonowanie to nie tylko tworzenie kopii genu lub innego składnika komórkowego, ale także zmiana genu w sekwencji DNA, a następnie jego replikacja. Aby amplifikować dowolną sekwencję DNA w żywym organizmie, sekwencja musi być połączona z początkiem replikacji i zdolna do kierowania propagacją siebie i dowolnej powiązanej sekwencji (na przykład: Rapid DNA Dephos & Ligation Kit może być używany do klonowania).

Znaczenie/zastosowanie klonowania molekularnego

Klonowanie molekularne jest wykorzystywane do następujących celów:

• Służy do badania białek i ich funkcji. Korzystając z rekombinowanego DNA, naukowcy mogą kierować replikacją (produkcją rekombinowanych białek) i manipulować komórkami za pomocą klonowania, tym samym dowiadując się więcej o konkretnych białkach i stosując tę wiedzę do badań na większą skalę, takich jak choroby i patogeny.¹
• Pomaga w badaniu sekwencji genomowej wielu różnych gatunków (w tym ludzi i innych zwierząt) i tworzeniu organizmów transgenicznych, takich jak rośliny odporne na herbicydy itp.
• Jest stosowany w cyklu komórkowym, organizacji genomu, ekspresji genów i terapii genowej. Jest również przydatna w odkrywaniu nowych leków i syntezie nowych szczepionek rekombinowanych.
• Działa jako ważne narzędzie w mikrobiologii klinicznej ze względu na swoją prostotę, opłacalność, szybkość i niezawodność. Przemysłowe zastosowanie tej technologii prowadzi do produkcji nowych antybiotyków w postaci peptydów przeciwdrobnoustrojowych i rekombinowanych cytokin, które mogą być stosowane jako środki terapeutyczne.¹
• Za pomocą tej technologii opracowywane są sondy genowe, które mają wiele przydatnych ról we wczesnej diagnostyce chorób dziedzicznych, dochodzeniach sądowych i rutynowej diagnostyce.¹

Proces klonowania molekularnego

Klonowanie dowolnego fragmentu DNA zasadniczo obejmuje następujące kroki:

• Wybór wektora do klonowania (na przykład: PSF-OXB20-FLUC - BACTERIAL LUCIFERASE PLASMID lub PSF-OXB20-BETAGAL - BACTERIAL BETA GALACTOSIDASE PLASMID lub PSF-OXB20 - STRONG BACTERIAL PROMOTER PLASMID i organizm gospodarza. Aby uzyskać pomoc w wyborze wektora, zobacz nasz Przewodnik wyboru wektora ekspresji
  
• Przygotowanie DNA wektora (na przykład: GenElute™ Plasmid Midiprep Kit, Plazmidowe DNA z E. coli RRI)
• Przygotowanie fragmentu DNA, który musi zostać sklonowany
• Tworzenie rekombinowanego DNA przy użyciu ligazy DNA (na przykład: T4 DNA Ligase)
• Wprowadzenie lub wstawienie rekombinowanego DNA do organizmu gospodarza:
• Wprowadzenie DNA do organizmu gospodarza zależy od wybranej metody eksperymentalnej (tj.transformacja, transdukcja, transfekcja, elektroporacja)
• Selekcja organizmów zawierających sekwencje wektorowe
• Screening klonów z pożądanymi wstawkami DNA i właściwościami biologicznymi

Szczegółowy artykuł na temat klonowania molekularnego można znaleźć w Podręczniku biologii molekularnej.

W procesie klonowania molekularnego napotyka się różne problemy, które można sprawdzić. Poniżej znajduje się kilka możliwych przyczyn i zalecanych rozwiązań:

Wybór wektora

Podczas klonowania należy wziąć pod uwagę te cztery segmenty DNA; brak któregokolwiek z nich może powodować problemy:

• Początek replikacji DNA jest niezbędny (do replikacji wewnątrz gospodarza)
• Jedno lub więcej unikalnych miejsc rozpoznawania endonukleazy restrykcyjnej (gdzie można wprowadzić obce DNA)
• Selektywny gen markera genetycznego używany do umożliwienia przetrwania komórek, które pobrały sekwencje wektora
• Dodatkowy gen (używany do badań przesiewowych komórek zawierających obce DNA)

Przygotowanie fragmentu DNA

Niekompletne trawienie enzymem restrykcyjnym (RE)

• Niekompletne trawienie enzymem restrykcyjnym (RE): Należy sprawdzić wrażliwość enzymu(ów) na metylację, użyć zalecanego buforu dostarczonego z enzymem restrykcyjnym. Oczyszczenie DNA w celu usunięcia zanieczyszczeń, które mogą hamować działanie enzymu. (Można użyć następujących produktów w celu uzyskania lepszych wyników)
  
• Inhibicja soli: Kilka enzymów jest wrażliwych na sól, więc DNA należy oczyścić przed trawieniem.
• Inhibicja składników PCR: Konieczność oczyszczenia fragmentu PCR przed trawieniem restrykcyjnym.
• Użycie niewłaściwego buforu: Należy używać wyłącznie zalecanego buforu dostarczonego wraz z enzymem restrykcyjnym. (Podwójne trawienie: Trawienie substratu DNA dwoma enzymami restrykcyjnymi jednocześnie nazywane jest podwójnym trawieniem i jest powszechną procedurą oszczędzającą czas) W przypadku podwójnego trawienia należy wybrać odpowiedni bufor, który spowoduje największą aktywność obu enzymów. Należy przestrzegać zalecanego protokołu. W przypadku, gdy konieczne są dwie różne temperatury inkubacji, należy wybrać optymalny bufor reakcyjny i odpowiednio skonfigurować reakcję.
• Jeśli użyto zbyt mało jednostek enzymu: Ogólnie zaleca się stosowanie co najmniej 3-5 jednostek enzymu na μg DNA.
• Krótki okres inkubacji: Konieczność wydłużenia czasu inkubacji.

Trawione DNA przebiegało jako rozmaz na żelu agarozowym.

• Enzym(y) restrykcyjny(e) mogą być związane z substratem DNA: Należy dodać SDS 0.1-0,5% (na przykład: Roztwór dodecylosiarczanu sodu) do buforu ładującego, aby oddzielić enzym od DNA.
• Zanieczyszczenie nukleazą: Pomocne może być użycie świeżego, czystego buforu roboczego i świeżego żelu agarozowego (na przykład: Agaroza, niska temperatura żelowania), a także oczyszczenie DNA.

Dodatkowe pasma lub rozmaz na żelu

Jeśli w żelu widoczne są większe pasma niż oczekiwano, może to wskazywać na wiązanie enzymu (enzymów) z substratem: Może być konieczne zmniejszenie liczby jednostek w reakcji i dodanie SDS 0,1-0,5% (na przykład: roztwór dodecylosiarczanu sodu) do buforu ładującego w celu odłączenia enzymu od substratu może pomóc.

Temperatura wyżarzania może być zbyt niska: Należy określić prawidłową temperaturę wyżarzania starterów. (Na przykład: KiCqStart^® SYBR^® Green Primer,  Hexanucleotide Primers mogą być użyte).

Brak amplifikacji fragmentu PCR

Może to być spowodowane następującymi przyczynami, które należy sprawdzić podczas eksperymentu²:

• Użycie niewłaściwej sekwencji starterów lub błąd w starterach PCR
• Nieprawidłowa temperatura annealingu i wydłużania
• Nieprawidłowe stężenie starterów i zbyt mała liczba jednostek polimerazy: Konieczność użycia zalecanego przez producenta stężenia starterów i jednostek polimerazy w oparciu o objętość reakcji.
• Stężenia Mg²⁺ , pH buforu i warunki cyklu w reakcji:  Potrzeba wysokiej optymalizacji dla reakcji amplifikacji.

Tworzenie rekombinowanego DNA przy użyciu ligazy DNA

• Użycie maksymalnej mieszaniny ligacyjnej: Należy użyć zalecanej ilości reakcji ligacji do transformacji. (Na przykład: QuickLink™ DNA Ligation Kit oraz Zestaw do szybkiej ligacji DNA może być używany do wysokiej wydajności i szybkiej ligacji.
• Nieefektywna ligacja: Potwierdź, że co najmniej jeden fragment musi być ligowany zawierający cząsteczkę fosforanową 5´. Oczyść DNA w celu usunięcia zanieczyszczeń, takich jak sól i EDTA. Usunąć fosfatazę przed ligacją. Potwierdzenie aktywności ligazy poprzez przeprowadzenie kontroli ligacji może pomóc.
• Niewystarczająca fosforylacja:  Konieczność oczyszczenia DNA przed fosforylacją w celu usunięcia nadmiaru soli, fosforanów lub jonów amonowych, które mogą hamować kinazę.
• Niewystarczające stępienie: Inaktywacja cieplna lub usunięcie enzymów restrykcyjnych przed stępieniem i oczyszczenie fragmentu PCR przed stępieniem może pomóc.
• Nieefektywny A-Tailing: Konieczność oczyszczenia PCR przed A-tailingiem. Enzymy o wysokiej wierności usuną wszelkie nieszablonowe nukleotydy)

Ligowane DNA przebiegało jako rozmaz na żelu agarozowym

• Ligaza jest związana z substratem DNA: Konieczne jest potraktowanie reakcji ligacji Proteinazą K (na przykład: Proteinazą K z Tritirachium album) przed uruchomieniem na żelu.

Insercja rekombinowanego DNA do organizmu gospodarza

• Jeśli komórki nie są żywotne: Należy obliczyć wydajność transformacji komórek kompetentnych lub użyć dostępnych w handlu komórek kompetentnych o wysokiej wydajności. Na przykład: SIG10 Chemicznie Kompetentne Komórki (CMC0001) posiadają wysoką wydajność transformacji >1 x 10⁹ cfu/μg
• Gen zainteresowania (GOI) może być toksyczny dla komórek: Konieczność inkubacji płytek w niższej temperaturze lub użycie szczepu, który wywiera silniejszą kontrolę transkrypcyjną nad fragmentem DNA lub interesującym genem. Na przykład: CONTROLLER SIG10 Komórki chemicznie kompetentne mogą być używane.
• Jeśli używany jest niewłaściwy protokół szoku termicznego (dla komórek chemicznie kompetentnych): Należy postępować zgodnie z określonym przez producenta protokołem transformacji, a użycie zalecanej temperatury podczas szoku cieplnego będzie pomocne.
• Jeśli PEG jest obecny w mieszaninie ligacyjnej (dla komórek elektrokompetentnych): Wymaga oczyszczenia DNA przez dializę kropelkową przed transformacją.
• Jeśli nie zarejestrowano napięcia w przypadku komórek elektrokompetentnych: Potrzeba oczyszczenia DNA przed etapem ligacji i usunięcia wszelkich pęcherzyków powietrza. Należy przestrzegać parametrów elektroporacji określonych przez producenta.
• Zbudowane DNA jest zbyt duże: Należy wybrać kompetentny szczep komórkowy, który może być skutecznie transformowany dużymi konstruktami DNA lub pomocne może być zastosowanie elektroporacji. Na przykład: XLDNA SIG10 Electrocompetent cells mogą być używane do dużych konstrukcji i zwiększenia wydajności DNA.
• Konstruowanie fragmentu DNA, który może być podatny na rekombinację:  Należy sprawdzić. Na przykład: STEADY Chemically Competent Cells mogą być użyte.
• Do selekcji organizmów zawierających sekwencję wektora niezbędny jest selektywny marker (zwykle gen), który nadaje oporność na antybiotyk.
  Niewłaściwy antybiotyk lub jego stężenie: Konieczność potwierdzenia antybiotyku i optymalizacji jego stężenia. Marker selekcyjny użyty w wektorze również wymaga potwierdzenia. Na przykład Hygromycyna B z Streptomyces hygroscopicus może być użyta jako marker. Poniższa tabela zawiera kilka przykładów antybiotyków wraz z ich stężeniem roboczym.

Tabela 1. Niektóre powszechnie stosowane antybiotyki, ich mechanizm działania i ogólne stężenia robocze.

Nazwa antybiotyku	Klasa	Sposób działania*	Typ	Stężenie robocze**
Kanamycyna (Nr produktu. K1377)	aminoglikozyd	Wiąże podjednostkę rybosomalną 30S; powoduje błędną translację	bakteriobójczy	100 mg/L
Spectinomycyna (Nr produktu. S4014)	aminoglikozyd	Wiąże podjednostkę rybosomalną 30S; przerywa syntezę białek	Bakteriobójczy	7.5-20 mg/L
Ampicylina (Nr produktu. A6140, A9393 oraz A9518)	beta-laktam	Hamuje syntezę ściany komórkowej	Bakteriobójczy	20-60 µg/ml
Carbenicillin (Nr produktu. C3416)	beta-laktam	Hamuje syntezę ściany komórkowej	bakteriobójczy	100 µg/ml
Bleomycyna (Nr produktu. B5507)	glikopeptyd	Indukuje pęknięcia DNA	bakteriobójczy	10-100 µg/ml
Erytromycyna (Nr produktu. E6376)	makrolid	Blokuje podjednostkę rybosomalną 50S; hamuje translokację aminoacylu	Bakteriostatyczny	50-200 mg/L
Polimyksyna B (Nr produktu. P1004)	polipeptyd	Zmniejsza przepuszczalność błony zewnętrznej	bakteriobójczy	10-100 µg/ml
Tetracyklina (Nr produktu. T3383)	tetracyklina	Wiąże podjednostkę rybosomalną 30S; hamuje syntezę białek (etap wydłużania)	bakteriostatyczny	10 mg/ml
Chloramfenikol (Nr produktu. C0378)		Wiąże podjednostkę rybosomalną 50S; hamuje translokację peptydylową	Bakteriostatyczny	10-20 µg/ml
*W prokariotach. **Rozpuścić w ultraczystej wodzie i sterylnie przefiltrować, o ile nie określono inaczej.

Oprócz możliwych przyczyn wskazanych w Przewodniku rozwiązywania problemów, następujące problemy mogą być również związane z niską wydajnością transformacji lub jej brakiem i można je sprawdzić.

• Zanieczyszczenia w DNA: Konieczność usunięcia fenolu, białek, detergentów i etanolu z roztworu DNA w przypadku korzystania z chemicznie kompetentnych komórek (tj.BL21(DE3)). Etanol wytrąca się podczas ligacji w celu oczyszczenia plazmidowego DNA przy użyciu komórek elektrokompetentnych, tj.BL21(DE3)   (ponieważ sól i bufory silnie hamują elektroporację i zwiększają ryzyko powstania łuku elektrycznego). DNA można również rozpuścić w sterylnej wodzie, aby sprawdzić, czy nie ma dalszych zanieczyszczeń.
• Nadmiar DNA lub objętość: Należy to sprawdzić i przygotować tylko zalecaną objętość w zależności od rodzaju użytych komórek.
• Niska lub słaba ekspresja oporności na antybiotyki: Pożywka S.O.C. jest zalecana do ekspresji zamiast pożywki LB, ponieważ zmniejsza wydajność transformacji o 2-3 razy.
• Nieprawidłowe przechowywanie i obchodzenie się z kompetentnymi komórkami: Komórki kompetentne należy przechowywać w temperaturze -80 °C, a nie w ciekłym azocie. Komórki kompetentne powinny być używane natychmiast po rozmrożeniu i pozostawać zimne w lodzie do momentu użycia. Zminimalizuj liczbę cykli zamrażania-rozmrażania.
• Powolny wzrost lub brak wzrostu komórek lub nadmierny wzrost: Stosowanie zalecanej temperatury może pomóc w prawidłowym wzroście komórek. W przypadku nadmiernego wzrostu należy zwrócić szczególną uwagę na stosowany antybiotyk i jego stężenie.
• Nieprawidłowe obliczenia: Upewnij się, że do obliczenia wydajności stosowane są prawidłowe współczynniki rozcieńczenia i ilości DNA.

Przesiewanie klonów

Kolonie bez plazmidu:

• Niewystarczająca ilość użytego antybiotyku:  Konieczność zwiększenia poziomu antybiotyku na płytkach do zalecanej ilości i użycie świeżych płytek ze świeżymi antybiotykami może pomóc. Patrz tabela 1.
• Wybór kolonii satelitarnych: Należy wybrać duże, dobrze rozwinięte kolonie do dalszej analizy.
  (Kolonie satelitarne to bardzo małe kolonie komórek rosnących wokół kolonii odpornej na antybiotyki, które przyjęły niewłaściwy plazmid. Kolonia odporna na antybiotyk uwalnia enzymy, które degradują antybiotyk. Kolonie satelitów nie rosną po przeniesieniu na świeżą pożywkę, więc nie są brane pod uwagę w dalszej analizie.)

Kolonie zawierające nieprawidłowy/nieprawidłowy konstrukt mogą być spowodowane:

• Rekombinacją plazmidu (wektora)
• Nieprawidłowy amplikon PCR użyty podczas klonowania: Potrzeba optymalizacji warunków PCR.
• Obecność wewnętrznego miejsca rozpoznawania: Konieczność analizy sekwencji wstawki pod kątem obecności wewnętrznego miejsca rozpoznawania.
• Obecność mutacji/błędów w sekwencji:
  • Użycie polimerazy DNA o niskiej wierności: Użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności, na przykład z aktywnością Proofreading: Dalsze powtórzenie reakcji sekwencjonowania może być pomocne.
  • DNA uszkodzone przez światło UV podczas wycinania z żelu: Podczas wycinania DNA z żelu agarozowego zaleca się stosowanie lampy UV o długiej fali (360 nm).

Uwagi dotyczące klonowania PCR

• Natura wstawki lub użytego fragmentu: Wydajność fragmentu PCR różni się ze względu na rozmiar fragmentu, toksyczność wstawki i złożoność wstawki.
• Rozmiar wstawki: Małe fragmenty DNA są brane pod uwagę w celu uzyskania wysokiej wydajności.
• Stosunek wektora do wstawki:  Bardzo ważne i krytyczne jest zoptymalizowanie stosunku stężenia molowego wektora do wstawki w celu wydajnego klonowania.
• Użycie czystego produktu PCR: Zaleca się użycie czystego produktu PCR, a w niektórych przypadkach pomocne jest użycie świeżego produktu. (Na przykład: rAPid Alkaline Phosphatase może być użyta do oczyszczenia produktu PCR poprzez usunięcie dNTPs).
• Użycie kontroli pozytywnej i negatywnej: Niezbędne jest posiadanie odpowiedniej kontroli pozytywnej i negatywnej do oceny wyników klonowania.
• Kompatybilność końców DNA wektora i wstawki: Należy to sprawdzić, a dla pomyślnego klonowania ważne jest użycie właściwej polimerazy z wektorem do klonowania. Zastosowanie wektora SnapFast™ sprawia, że klonowanie jest wydajne i łatwe, ponieważ ułatwia przenoszenie DNA z jednego wektora do drugiego. Jest kompatybilny z wieloma wcześniej istniejącymi wektorami do klonowania i szeregiem wektorów wahadłowych, aby ułatwić transfer genów z wysokim wskaźnikiem sukcesu.
• Właściwe zaprojektowanie starterów PCR do przodu i do tyłu, a także sond ma kluczowe znaczenie.³

Referencje

1. Sharma K, Mishra AK, Mehraj V, Duraisamy GS. 2014. Advances and applications of molecular cloning in clinical microbiology. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 30(1):65-78. https://doi.org/10.1080/02648725.2014.921501

2. Roux KH. 2009. Optimization and Troubleshooting in PCR. Cold Spring Harbor Protocols. 2009(4):pdb.ip66-pdb.ip66. https://doi.org/10.1101/pdb.ip66

3. Raso A, Mascelli S, Nozza P, Ugolotti E, Vanni I, Capra V, Biassoni R. 2011. Troubleshooting fine-tuning procedures for qPCR system design. J. Clin. Lab. Anal.. 25(6):389-394. https://doi.org/10.1002/jcla.20489

4. Canene-Adams K. 2013. Explanatory Chapter.271-278. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-418687-3.00022-7

5. Lorenz TC. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. JoVE.(63): https://doi.org/10.3791/3998

6. Fulton TL, Stiller M. 2012. PCR Amplification, Cloning, and Sequencing of Ancient DNA.111-119. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-516-9_15

7. Mergulhão F, Kelly A, Monteiro G, Taipa MA, Cabral JM. Troubleshooting in Gene Splicing by Overlap Extension: A Step-Wise Method. MB. 12(3):285-288. https://doi.org/10.1385/mb:12:3:285

Prosimy o kontakt z naszym wsparciem technicznym, jeśli problem z klonowaniem nie ustąpi.