Protokoły transformacji bakterii

Transformacja jest kluczowym procesem w klonowaniu molekularnym, w którym wytwarzanych jest wiele kopii rekombinowanych cząsteczek DNA. Zdolność do pobierania wolnego, pozakomórkowego materiału genetycznego jest warunkiem wstępnym dla bakteryjnych komórek kompetentnych do transformacji. Celem jest uzyskanie replikacji sekwencji interesującego nas rekombinowanego plazmidu.

Rysunek 1. Transformacja

Przed rozpoczęciem transformacji:

• Przygotuj płytki z agarem LB i pozostaw do zastygnięcia. Jeśli używane są wstępnie wylane płytki, upewnij się, że płytki są ogrzane do 37 °C.
• W zależności od markera antybiotykowego obecnego w DNA plazmidu, dodaj odpowiedni antybiotyk do agaru LB.
• Jeśli wymagane jest niebieskie/białe badanie przesiewowe dla rekombinantów, dodaj 1 mM IPTG, 300 µg/ml S-Gal lub 40 µg/ml X-Gal i 500 µg/ml cytrynianu żelazowo-amonowego do agaru LB.
• Jeśli używane są komórki elektrokompetentne, umieść komorę do elektroporacji na lodzie.
• Podgrzej łaźnię wodną do 37°C.
• Podgrzej sterylne podłoże SOC do temperatury pokojowej (lub 20-25°C w łaźni wodnej).

Protokół transformacji przy użyciu komórek chemicznie kompetentnych

Materiały wymagane, ale niedostarczane:

Odczynniki	Sprzęt
Podłoże SOC (Nr produktu. S1797)	Inkubator z wytrząsarką (37 °C)
LB agar EZMix™ (Nr produktu. L7533)	Kombinator inkubacyjny (37 °C)
Właściwy antybiotyk selekcyjny	Podgrzewana łaźnia wodna (37 °C)
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) (Nr produktu. I6758)	15 mL polipropylenowe probówki hodowlane (sterylne)
X-gal (Nr produktu. B9146)	Naczynia hodowlane
S-Gal™ (Nr produktu. S9811)	Sterylne rozsiewacze Lazy-L (Nr produktu. Z376779)
Ferric Ammonium citrate (Product No. F5879)

Standardowy protokół transformacji

1. Przenieś wymaganą liczbę probówek z zamrażarki -70°C do mokrego lodu. W razie potrzeby dołączyć dodatkową probówkę na kontrolne DNA
2. Pozwolić komórkom rozmrażać się przez 5 minut. Delikatnie stuknij probówki wiele razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę
   1. Dla kontroli: Dodaj 1 µL (10 ng) kontrolnego DNA pUC19 do jednej probówki. Wymieszać delikatnie stukając i umieścić na lodzie
   2. Dodać 1 ng do 50 ng oczyszczonego plazmidowego DNA bezpośrednio do komórek w pozostałych probówkach. Wymieszaj delikatnie stukając i umieść na lodzie
3. Inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut
4. Przenieś komórki do łaźni wodnej 37° C na dokładnie 45 sekund
5. Przenieś komórki do lodu na 2 minuty
6. Dodaj pożywkę SOC do każdej probówki. Przenieś komórki do sterylnych probówek polipropylenowych i poluzuj zakrętki, aby ułatwić napowietrzanie hodowli
7. Inkubuj komórki w inkubatorze z wytrząsarką (225-250 obr./min.) w temperaturze 37°C przez 1 godzinę
8. Nanieś pipetą 10-100 µL każdej zawiesiny transformowanych komórek na płytki z agarem LB z antybiotykiem selekcyjnym i rozprowadź za pomocą sterylnego rozsiewacza<
9. Inkubować płytki w temperaturze 37°C przez noc
10. Wybrać kolonię (kolonie) i hodować w razie potrzeby
11. Izolować plazmidowe DNA z każdej hodowli
12. Hodować preferowane klony
13. Trawić plazmidowe DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych; oddzielić za pomocą elektroforezy żelowej

Protokół transformacji z wykorzystaniem komórek elektrokompetentnych

Materiały wymagane, ale niedostarczane:

Odczynniki	Sprzęt
Podłoże SOC (Nr produktu. S1797)	Inkubator z wytrząsarką (37 °C)
LB agar EZMix™ (Nr produktu. L7533)	Komora inkubacyjna (37 °C)
Właściwy antybiotyk selekcyjny	Podgrzewana łaźnia wodna (37 °C)
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) (Nr produktu. I6758)	15 mL polipropylenowe probówki hodowlane (sterylne)
X-gal (Nr produktu. B9146)	Naczynia hodowlane
S-Gal™ (Nr produktu. S9811)	Sterylne rozsiewacze Lazy-L (Nr produktu. Z376779)
Ferric Ammonium citrate (Product No. F5879)	Naczynia hodowlane

Standardowy protokół transformacji

1. Przenieś wymaganą liczbę probówek z zamrażarki -70°C do mokrego lodu. W razie potrzeby dołącz dodatkową probówkę na kontrolne DNA.
2. Pozwól komórkom rozmrażać się przez 5 minut. Delikatnie stuknij w probówki wiele razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę.
3. Przenieś pożywkę SOC do probówek hodowlanych, po jednej dla każdej reakcji transformacji i pozostaw w temperaturze pokojowej.
   
   (Objętość pożywki SOC zależy od objętości komórek, które zostaną dodane w następnym kroku. Końcowa objętość z kompetentnymi komórkami i pożywką SOC powinna wynosić 1000 µL)
4. Umieść 1 mm standardowe kuwety i sterylne probówki do mikrowirówki na lodzie, po jednej dla każdej reakcji transformacji.
5. Przenieś kompetentne komórki do schłodzonych probówek do mikrowirówki. Użyj 40 µL komórek z opakowania 80 µL i 50 µL komórek z opakowania 100 µL.
   1. Dla kontroli: Dodaj 1 µL 1 do 5 rozcieńczonego kontrolnego DNA pUC19 do jednej probówki.
   2. Przygotuj 1 do 5-krotne rozcieńczenie DNA lub mieszaniny ligacyjnej w buforze TE. Dodaj do probówek typu microfuge.
6. Pipetuj mieszaninę DNA i komórek do schłodzonej kuwety 1 mm.
7. Ustaw elektroporator na natężenie pola 25 kV/cm przez 6 ms i poddaj komórki działaniu.
8. Wyjmij komórki z kuwet i dodaj do probówek zawierających pożywkę SOC.
9. Inkubuj komórki w inkubatorze z wytrząsarką (225-250 obr./min) w temperaturze 37°C przez 1 godzinę
10. Nanieś pipetą 10-100 µL każdej zawiesiny transformowanych komórek na płytki z agarem LB z antybiotykiem selekcyjnym i rozprowadź za pomocą sterylnego rozsiewacza.
11. Inkubować płytki w temperaturze 37°C przez noc.
12. Wybrać kolonię i hodować w razie potrzeby.
13. Wyizolować plazmidowe DNA z każdej hodowli.
14. Trawić plazmidowe DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych; oddzielić za pomocą elektroforezy żelowej.
15. Hodować preferowane klony.

Ważne wskazówki dotyczące optymalizacji procesu transformacji:

• Sprawdź, czy komórki są nadal zamrożone, a suchy lód jest nadal obecny po ich otrzymaniu.
• W celu uzyskania maksymalnej wydajności transformacji należy użyć wysokiej jakości próbki DNA wolnej od fenolu, etanolu, białek, soli lub detergentów. Podczas korzystania z komórek elektrokompetentnych, wysoka zawartość soli w DNA spowoduje powstanie łuku elektrycznego przy wysokim napięciu, co może uszkodzić próbkę i sprzęt.
• DNA w reakcjach ligacji zawierających wysokiej jakości odczynniki może być używane do transformacji. Ligaza DNA nie musi być inaktywowana.
• Kompetentne komórki należy trzymać na lodzie przez cały czas; należy zapobiegać przypadkowemu ogrzaniu komórek.
• Delikatnie uderzaj w probówki, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek. Nie mieszaj za pomocą worteksu lub pipety.
• Ogrzej płytki agarowe LB do 37 °C dla optymalnego wzrostu kolonii.
• Ustawienia elektroporatora do transformacji przy użyciu komórek elektrokompetentnych:
  • BTX Model ECM 630: Tryb HV, 2,5 kV, 25 µF, 100 Ω, kuweta 1 mm
  • BioRad Gene Pulser: 2,5 kV, 25 µF, 100 Ω, kuweta 1 mm

Materiały

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Referencje

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual.. New York: Cold spring harbor laboratory press.

2. Dubnau D. 1999. DNA Uptake in Bacteria. Annu. Rev. Microbiol.. 53(1):217-244. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.53.1.217

3. Lorenz MG, Wackernagel W. 1994. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment.. 58(3):563-602. https://doi.org/10.1128/mmbr.58.3.563-602.1994