Protokół zestawu do transfekcji fosforanem wapnia

Wprowadzenie

Transfekcja fosforanem wapnia jest powszechnie stosowaną metodą wprowadzania DNA do komórek eukariotycznych. Technika ta została wykorzystana do uzyskania zarówno przejściowej¹ jak i stabilnej² transfekcji w wielu różnych typach komórek. Procedura opiera się na powolnym mieszaniu buforowanej soli fizjologicznej HEPES zawierającej fosforan sodu z roztworem CaCl₂ zawierającym DNA. Tworzy się kopolimer DNA z fosforanem wapnia, który przylega do powierzchni komórki i jest pobierany przez komórkę, prawdopodobnie na drodze endocytozy. Szok glicerolowy może zwiększyć wychwyt DNA w niektórych typach komórek.

Dostarczone odczynniki

Odczynniki dostarczane w zestawie do transfekcji fosforanem wapnia (nr produktu CAPHOS) są sterylizowane przez filtr 0,2 µM i aseptycznie napełniane. Zestaw pozwala na wykonanie:

• 80 transfekcji na płytkach o średnicy 10 cm
• lub 160 transfekcji na płytkach o średnicy 6 cm (około 25 x 6 dołków)
• lub 400 transfekcji na płytkach o średnicy 3,5 cm (około 36 x 12 dołków).5 cm (w przybliżeniu 36 X 12-dołkowe płytki)

Zestaw do transfekcji fosforanem wapnia (nr produktu CAPHOS) zawiera następujące elementy:

• 1 fiolka 2.5M CaCl₂  (Product No. C2052)
• 1 fiolka (25 mL) wody klasy biologii molekularnej (Product No. W4502)
• 1 fiolka (25 mL) 2x HEPES Buffered Saline, pH 7.05 (Product No. H1012)
  50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na₂HPO₄

Przechowywanie

Przechowywać wszystkie składniki w temperaturze -20 °C.

Procedura

Podana poniżej procedura jest przeznaczona do transfekcji komórek CHO plazmidem pSV40-CAT o stężeniu 1 µg/µL (rozcieńczonym w sterylnej wodzie klasy biologii molekularnej). Komórki należy hodować w standardowej pożywce zawierającej surowicę lub bez surowicy, odpowiedniej dla danego typu komórek. Nie zaleca się stosowania antybiotyków. Stosować dobrą technikę aseptyczną i używać wyłącznie sterylnych materiałów.

Plazmidy DNA powinny być wysokiej jakości, wytrącone etanolem, ponownie zawieszone w wodzie klasy biologii molekularnej do końcowego stężenia 1 µg/µL.

Protokół ten można zoptymalizować do użytku z szeroką gamą typów komórek. Gęstość wysiewu, ilość użytego DNA, czas inkubacji i szok glicerolowy można łatwo zmieniać, aby osiągnąć wyższą ekspresję i niższą toksyczność w razie potrzeby.

Dzień pierwszy: Płytkowanie komórek

Płytkuj komórki zgodnie z poniższą tabelą:

Culture Dish	Cell Plating Density
3.5 cm naczynie	2 x 105
6 cm naczynie	5 x 105
Naczynie 10 cm	1 - 2 x 106

Dzień drugi: Transfekcja

1. Aby przygotować komórki do transfekcji, dodaj świeżą kompletną pożywkę zgodnie z poniższą tabelą:

.

Naczynie hodowlane	Dodana świeża pełna pożywka (mL)
Naczynie 3.5 cm naczynie	1
6 cm naczynie	2
Naczynie 10 cm	4

2. Dwie godziny później przygotuj dwie probówki z odczynnikami do transfekcji w następujący sposób:

Naczynie hodowlane	Tuba A (delikatnie wymieszaj)			Tuba B
		CaCl2 (µL)	H2O (µL)	DNA (µL)	HeBS (µL)
3.5 cm naczynie	6	49	5	60
6 cm naczynie	15	123	12	150
Naczynie 10 cm	30	245	25	300

3. Rozpuścić HeBS (probówka B) za pomocą automatycznej pompy pipetowej podłączonej do pipety serologicznej o pojemności 1 ml wyposażonej w końcówkę pipety 200 uL.

4. Podczas rozpylania HeBS (probówka B), dodać zawartość probówki A (z kroku 2), kroplami.

5. Worteksować przez 2 - 4 sekundy.

6. Pozostawić osad na 20 minut w spokoju.

7. Rozprowadź roztwór równomiernie na pożywce do hodowli komórkowej na płytce. Delikatnie wymieszaj naczynie, aby równomiernie rozprowadzić osad na komórkach na płytce.

8. Inkubować komórki przez noc (około 16 godzin).

Dzień trzeci: Opcjonalny szok glicerolowy

1. Zmieszaj następujące składniki w probówce wirówkowej:

.

Naczynie hodowlane	50% sterylny glicerol (µL)	2x HeBS (µL)	H2O (µL)
3.5 cm naczynie	100	250	150
Naczynie 6 cm	225	565	335
Naczynie 10 cm	450	1130	670

2. Usunąć pożywkę z naczynia i zastąpić roztworem glicerolu. Inkubować 2 minuty.

3. Usunąć roztwór glicerolu i przemyć dwukrotnie PBS:

3.

Naczynie hodowlane	Objętość PBS dla każdego płukania (ml)
Naczynie 3.5 cm naczynie	2
6 cm naczynie	5
10 cm naczynie	10

Dzień trzeci: Zmiana pożywki

1. Po całonocnej inkubacji (lub opcjonalnym szoku glicerolowym), odessać pożywkę (lub PBS) i zastąpić ją kompletną pożywką.
2. Inkubuj komórki przez 48 godzin.
3. Zbierz i lizuj komórki - są one gotowe do użycia w innych zastosowaniach.

.

Referencje

1. Graham F, van der Eb A. 1973. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52(2):456-467. https://doi.org/10.1016/0042-6822(73)90341-3

2. Wigler M, Pellicer A, Silverstein S, Axel R. 1978. Biochemical transfer of single-copy eucaryotic genes using total cellular DNA as donor. Cell. 14(3):725-731. https://doi.org/10.1016/0092-8674(78)90254-4