Protokół uniwersalnego odczynnika do transfekcji

Numer produktu: T0956

Wprowadzenie

Nasz Universal Transfection Reagent to unikalna formuła zastrzeżonej mieszanki polimerów. Uniwersalny odczynnik do transfekcji jest stosowany do przejściowej i stabilnej transfekcji kwasów nukleinowych do różnych eukariotycznych linii komórkowych i trudnych do transfekcji komórek pierwotnych. Ten szybki i łatwy protokół jest kompatybilny z surowicą, pożywką bez surowicy i antybiotykami. 

Dostarczone odczynniki

Universal Transfection Reagent jest dostarczany jako 1 ml płynu w pojedynczej fiolce. Objętość ta pozwala na przeprowadzenie:

• 40 transfekcji na szalkach o średnicy 10 cm, lub
• 65 transfekcji na szalkach o średnicy 6 cm, lub
• 110 transfekcji na szalkach o średnicy 3,5 cm.

Przechowywanie

Universal Transfection Reagent może być przechowywany w temperaturze 2-8 °C przez okres do trzech miesięcy. W przypadku przechowywania długoterminowego należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem wszystkie składniki zestawu należy rozmrozić i wyrównać do temperatury pokojowej.

Procedura

Podana poniżej procedura jest przeznaczona do transfekcji popularnych linii komórkowych plazmidem DNA o stężeniu 1 µg/µl (rozcieńczonym w sterylnej wodzie do biologii molekularnej). Hoduj i transfekuj komórki w standardowej pożywce zawierającej surowicę lub bez surowicy, odpowiedniej dla danego typu komórek.  Stosuj dobrą technikę aseptyczną i używaj wyłącznie sterylnych materiałów.

Plazmidy DNA powinny być wysokiej jakości, wytrącone etanolem, ponownie zawieszone w wodzie do biologii molekularnej do końcowego stężenia 1 µg/µl. Optymalna ilość uniwersalnego odczynnika do transfekcji zależy od typu komórek i wynosi zazwyczaj 1 - 3 µL na ug plazmidowego DNA.

Obecność surowicy (5%) i antybiotyków nie hamuje transfekcji, a w niektórych przypadkach zwiększa jej wydajność. Transfekcja komórek w obecności surowicy minimalizuje toksyczność.

Ten protokół może być zoptymalizowany do użytku z szeroką gamą typów komórek. Gęstość wysiewu, ilość użytego DNA i czas inkubacji można łatwo zmieniać, aby osiągnąć wyższą ekspresję i niższą toksyczność w razie potrzeby.

Hodowla adherentna

Dzień 1: Płytkowanie komórek

Płytkuj komórki 18-24 godziny przed transfekcją. Należy zastosować odpowiednią gęstość wysiewu, aby płytka do hodowli komórkowej była w 90-95% konfluentna w czasie transfekcji. Do hodowli komórek można użyć pożywki zawierającej surowicę lub pożywki bez surowicy odpowiedniej dla typu komórek. 

Dzień 2: Transfekcja

1. Aby przygotować komórki do transfekcji, zmień pożywkę w każdej studzience hodowlanej. Objętości podane poniżej pozwolą na transfekcję jednej studzienki w płytce 6-dołkowej; patrz Tabela 1 dla objętości przy użyciu innych naczyń hodowlanych.
2. Tuba A: aby przygotować DNA, dodaj 1 µg plazmidowego DNA do 50 µL DMEM (o wysokiej zawartości glukozy, bez surowicy). Delikatnie worteksować.
3. Probówka B: aby przygotować odczynnik do transfekcji, w oddzielnej probówce dodać 3 µL uniwersalnego odczynnika do transfekcji do 50 µL DMEM (o wysokiej zawartości glukozy, bez surowicy). Delikatnie worteksować.
4. Natychmiast dodać probówkę B do probówki A (Uwaga: nie odwracać kolejności dodawania). Natychmiast wymieszać i delikatnie odwirować. Pozostaw kompleksy na 15-20 minut w temperaturze pokojowej (Uwaga: nie pozwól, aby reakcja kompleksowania trwała dłużej niż 20 minut).
5. Dodaj 100 µl kompleksów, kroplami, do studzienki hodowlanej (zawierającej komórki i pożywkę). Wymieszać przez delikatne wirowanie.

Tabela 1

		Tuba A		Tuba B
Naczynie hodowlane	Objętość podłoża na studzienkę (ml)	Całkowita ilość DNA na płytkę (µL)	DMEM do rozcieńczania DNA (µL)	Całkowita ilość uniwersalnego odczynnika do transfekcji na płytkę (µL)	DMEM do rozcieńczania uniwersalnego odczynnika do transfekcji (µL)
Płytka 96-dołkowa	0.2	0,2	10	0,6	10
48-dołkowa płytka	0.5	0,5	20	1,5	20
24-dołkowa płytka	0.8	1	50	3	50
Płytka 12-dołkowa	1	1.5	100	4.5	100
Płytka 6-dołkowa	2	2	150	6	150
3.5 cm naczynie	2	3	100	9	100
6 cm naczynie	3	5	250	15	250
Naczynie 10 cm	6	8	500	24	500
kolba T-75	10	18-36	750	54-108	750

Dzień 2: Opcjonalna zmiana pożywki (komórki wrażliwe)

Całkowita zmiana pożywki może być przeprowadzona 5 - 24 godziny po transfekcji w przypadku bardzo wrażliwych komórek. W przypadku większości komórek zalecamy zmianę pożywki dopiero po 48 godzinach od transfekcji, dopóki optymalizacja protokołu nie będzie wymagała dodatkowej zmiany pożywki.

Dzień 4: Zmiana pożywki i sprawdzenie skuteczności transfekcji

1. Całkowitą zmianę pożywki należy przeprowadzić po 48 godzinach od transfekcji.
2. Pomiędzy 24-48 godzinami po transfekcji można określić wydajność, zebrać komórki do innych zastosowań lub rozpocząć stabilną selekcję, jeśli ma to zastosowanie.
   

Hodowla stacjonarna (komórki w zawiesinie)

Dzień 1: Posiew komórek

Posiew komórek na 18-24 godziny przed transfekcją. Gęstość wysiewu powinna wynosić 0,5 - 1,0 x 10⁶/mL, aby płytka do hodowli komórkowej była gotowa w momencie transfekcji. Do hodowli komórek można użyć pożywki zawierającej surowicę lub pożywki bez surowicy odpowiedniej dla typu komórek.

Dzień 2: Transfekcja

1. Aby przygotować komórki do transfekcji, usuń pożywkę z każdej studzienki hodowlanej i zastąp ją 0.Objętości podane poniżej pozwolą na transfekcję jednej studzienki w płytce 6-dołkowej; patrz Tabela 1 dla objętości przy użyciu innych naczyń hodowlanych.
2. Tuba A: aby przygotować DNA, dodaj 2 µg plazmidowego DNA do 100 µL DMEM (o wysokiej zawartości glukozy, bez surowicy). Delikatnie worteksować.
3. Probówka B: aby przygotować odczynnik do transfekcji, w oddzielnej probówce dodać 6 µL uniwersalnego odczynnika do transfekcji do 100 µL DMEM (o wysokiej zawartości glukozy, bez surowicy). Delikatnie worteksować.
4. Natychmiast dodać probówkę B do probówki A. (Uwaga: nie odwracać kolejności dodawania). Natychmiast wymieszać i delikatnie odwirować. Pozostawić kompleksy do utworzenia się w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut (Uwaga: nie dopuścić do kontynuowania reakcji kompleksowania dłużej niż 20 minut).
5. Dodać 200 µl kompleksów, kroplami, do studzienki hodowlanej (zawierającej komórki i pożywkę). Wymieszać delikatnie wirując.

Dzień 4: Zmiana pożywki i sprawdzenie skuteczności transfekcji

1. Całkowita zmiana pożywki powinna zostać przeprowadzona po 48 godzinach od transfekcji.
2. Pomiędzy 24-48 godzinami po transfekcji można określić wydajność, zebrać komórki do innych zastosowań lub rozpocząć stabilną selekcję, jeśli ma to zastosowanie.