Niebiesko-białe badania przesiewowe i protokoły selekcji kolonii

Identyfikacja rekombinowanych bakterii

Blue-white screening to szybka i skuteczna technika identyfikacji rekombinowanych bakterii. Opiera się ona na aktywności β-galaktozydazy, enzymu występującego w E. coli, który rozszczepia laktozę na glukozę i galaktozę.

Disrupting the LacZ Gene

Obecność laktozy w otaczającym środowisku uruchamia operon lacZ w E. coli. Aktywność operonu skutkuje produkcją enzymu β-galaktozydazy, który metabolizuje laktozę. Większość wektorów plazmidowych zawiera krótki segment genu lacZ, który zawiera informacje kodujące dla pierwszych 146 aminokwasów β-galaktozydazy. Stosowane szczepy gospodarza E. coli są kompetentnymi komórkami zawierającymi mutację delecyjną lacZΔM15. Gdy wektor plazmidowy jest pobierany przez takie komórki, w wyniku procesu α-komplementacji wytwarzany jest funkcjonalny enzym β-galatosidazy.

Wektory plazmidowe używane do klonowania są manipulowane w taki sposób, że proces α-komplementacji służy jako marker rekombinacji. Miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) jest obecne w sekwencji lacZ wektora plazmidowego. Sekwencja ta może być nacinana przez enzymy restrykcyjne w celu wstawienia obcego DNA. Gdy wektor plazmidowy zawierający obce DNA jest pobierany przez gospodarza E. coli, α-komplementacja nie zachodzi, dlatego funkcjonalny enzym β-galaktozydazy nie jest wytwarzany. Jeśli obce DNA nie zostanie wstawione do wektora lub jeśli zostanie wstawione w miejscu innym niż MCS, gen lacZ w wektorze plazmidowym uzupełnia mutację delecji lacZ w gospodarzu E. coli wytwarzając funkcjonalny enzym.

Jak działa badanie przesiewowe Blue White?

Do badania przesiewowego klonów zawierających rekombinowane DNA, chromogenny substrat znany jako X-gal jest dodawany do płytki agarowej. Jeśli wytwarzana jest β-galaktozydaza, X-gal jest hydrolizowany do postaci 5-bromo-4-chloro-indoksylu, który spontanicznie dimeryzuje, tworząc nierozpuszczalny niebieski pigment zwany 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo. Kolonie utworzone przez nierekombinowane komórki mają zatem niebieski kolor, podczas gdy kolonie rekombinowane są białe. Pożądane rekombinowane kolonie można łatwo zbierać i hodować.

Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) jest stosowany wraz z X-gal do niebiesko-białych badań przesiewowych. IPTG jest niemetabolizowalnym analogiem galaktozy, który indukuje ekspresję genu lacZ. Należy zauważyć, że IPTG nie jest substratem dla β-galaktozydazy, a jedynie induktorem. Do celów wizualnego badania przesiewowego wymagany jest substrat chromogenny, taki jak X-gal.

Rysunek 1. Schematyczna reprezentacja typowego wektora plazmidowego, który może być użyty do niebiesko-białych badań przesiewowych.

Rysunek 2. Schematyczne przedstawienie typowej niebiesko-białej procedury przesiewowej.

Produkty do przesiewania niebiesko-białego (materiały)

Numer produktu	Nazwa	Rozpuszczalność	Działanie	Zastosowanie	Nazwa	Rozpuszczalność	Działanie	Zastosowanie	Cechy szczególne
B6650.	X-GlcA	DMF	Substrat dla ß-galaktozydazy i ß-glukuronidazy	badanie przesiewowe wykrywania genów rekombinowanych bakterii	biało-niebieski screening
16658	X-GalNAc	DMF, DMSO	Substrat dla N-acetylo-ß-galaktozydazy	Screening rekombinowanych bakterii i Candida albicans	biało-niebieskie badania przesiewowe
S7313	S-Gal® sól sodowa	Woda	Substrat dla ß-galaktozydazy	przesiewowe wykrywanie genów rekombinowanych bakterii	niebiesko-białe badanie przesiewowe autoklawowalne wzmocniony kontrast do automatycznego zliczania kolonii
S9811.	S-Gal®	Woda	Substrat dla ß-galaktozydazy	badanie przesiewowe rekombinowanych bakterii	biało-niebieski screening autoklawowalny wzmocniony kontrast dla automatycznego zliczania kolonii
C4478	S-Gal®/LB Agar Blend	Woda	Substrat dla ß-galaktozydazy	przesiewanie rekombinowanych bakterii	przesiewanie niebiesko-białe autoklawowalne wzmocniony kontrast do automatycznego zliczania kolonii po dodaniu IPTG
B2904	Bluo-Gal	DMF	Substrat dla ß-galaktozydazy	badanie przesiewowe rekombinowanych bakterii	badanie przesiewowe niebiesko-białe nie wymaga sterylizacji
B3928	Blue-White Select™ Screening Reagent	Roztwór gotowy do użycia	Substrat dla ß-galaktozydazy	badania przesiewowe rekombinowanych bakterii	niebiesko-białe badania przesiewowe
16669	Magenta-Gal	DMF, DMSO	Substrat dla ß-galaktozydazy	badanie przesiewowe rekombinowanych bakterii	biało-czerwony screening
B8931	Magenta-Gal	Metanol	Substrat dla ß-galaktozydazy	badanie przesiewowe rekombinowanych bakterii	badanie przesiewowe czerwono-białe
B4252	5-bromo-4-chloro-3-indolilo ß-D-galaktopiranozyd	DMF, DMSO	substrat dla ß-galaktozydazy	badania przesiewowe rekombinowanych bakterii	badania przesiewowe niebiesko-białe można stosować do immunocytochemii nie wymaga sterylizacji
B9146	5-Bromo-4-chloro-3-indolilo ß-D-galaktopiranozyd	DMF, DMSO	Substrat dla ß-galaktozydazy	badania przesiewowe rekombinowanych bakterii	badania przesiewowe niebiesko-białe nie wymaga sterylizacji
B6024	5-Bromo-4-chloro-3-indolilo ß-D-galaktopiranozyd (tabletka)	DMF, DMSO	Substrat dla ß-galaktozydazy	badanie przesiewowe rekombinowanych bakterii	niebiesko-białe badanie przesiewowe nie wymaga sterylizacji
16665	5-bromo-4-chloro-3-indolilo ß-D-galaktopiranozyd	DMF, DMSO	Substrat dla ß-galaktozydazy	badania przesiewowe rekombinowanych bakterii	biało-niebieski screening brak konieczności sterylizacji
I1284	Roztwór ß-D-tiogalaktopiranozydu izopropylu	Roztwór gotowy do użycia	Indukuje promotor Lac	Screening rekombinowanych bakterii	niebiesko-białe badania przesiewowe można dodawać do pożywek hodowlanych
I6758	Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside	Woda	Indukuje promotor Lac	badanie przesiewowe rekombinowanych bakterii	badanie przesiewowe niebiesko-białe
I5502	Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside	Woda	Indukuje promotor Lac	badanie przesiewowe rekombinowanych bakterii	biało-niebieski screening

Protokoły badań przesiewowych Blue-White

Kompletny protokół badań przesiewowych Blue-White obejmuje 3 ważne etapy:

• Ligacja: ligacja obcego DNA do MCS wektora plazmidowego
• Transformacja: wprowadzenie wektora plazmidowego z wstawką obcego DNA do kompetentnego E. coli
• Screening: niebiesko-białe badanie przesiewowe w celu identyfikacji rekombinowanych kolonii bakteryjnych

Ligacja

Oferujemy następujące gotowe do użycia wektory ekspresyjne, które mogą być stosowane zarówno w stabilnych, jak i przejściowych systemach ekspresji. Te konstrukty fuzyjne FLAG mają początki replikacji do rozmnażania zarówno w komórkach bakteryjnych, jak i ssaczych.

Nr produktu	Nazwa	Kompatybilność
E6783	wektor ekspresyjny pFLAG-CMV™-3	bakterie, komórki ssaków
E7658	wektor ekspresjip3XFLAG-CMV™-10	bakterie, komórki ssaków
E7283	wektor ekspresyjnyp3XFLAG-myc-CMV™-26	Bakterie, komórki ssaków
E9033	wektor ekspresyjny pFLAG-Myc-CMV™-22	bakterie, komórki ssaków
E6908	pFLAG-CMV™-5.1 Expression Vector	Bakterie, komórki ssaków
E9408	wektor ekspresyjnyp3xFLAG-Myc-CMV™-25	.Bakterie, komórki ssaków
FLMAS	Mammalian Amino-terminal FLAG Stable Expression Kit	Bakterie, komórki ssaków
E8158	wektor ekspresyjny pFLAG-ATS™.	Bakterie
E8408	wektor ekspresyjny pFLAG-CTC™	bakterie
D3404	pUC19 plazmid DNA z E. coli RRI	Bakterie
D4154	pUC18 plazmid DNA z E. coli RRI	bakterii

Wymagane materiały

Odczynniki	.Sprzęt
Bufor ligazy DNA T4 (KEM0049B)	Probówki do reakcji PCR
Wektor plazmidowy	Termocykler (opcjonalnie)
Insert (obce DNA)	PCR clean-up column (NA1020)
Ligaza DNA T4 (KEM0020, KEM0019)
Jałowa, wolna od nukleaz woda

Poniżej przedstawiono konfigurację reakcji ligacji

Składnik	Objętość (µL)	Stężenie końcowe
Bufor ligazy DNA T4	2	1X
Vector	x	1-10 ng/µL
Insert	x	1-10 ng/µL
Ligazy DNA T4	1	6U/µL
Jałowa woda	x	NA
Objętość całkowita	20

• Dodaj wszystkie powyższe składniki do czystej probówki reakcyjnej.
• Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 25°C (można to zrobić w termocyklerze).
• Oczyść DNA za pomocą kolumny oczyszczającej PCR i eluuj w około 50 µL.
• Transformuj 0,1-10 ng produktu ligacji do komórek chemicznych lub elektrokompetentnych, które są kompatybilne z wektorem.

Transformacja

Wysokiej jakości plazmid jest niezbędny do przeprowadzenia procedury transformacji. Poniższe zestawy izolują i oczyszczają wysokiej jakości plazmid odpowiedni do transformacji.

Nr produktu	Nazwa
PLN10	GenElute™ Plasmid Miniprep Kit (10 preps)
PLN70	GenElute™ Plasmid Miniprep Kit (70 preps)
PLN350	GenElute™ Plasmid Miniprep Kit (350 preps)
PFM10	GenElute™ 5ute Plasmid Miniprep Kit (10 preps)
PFM50	GenElute™ 5ute Plasmid Miniprep Kit (50 preps)
PFM250	GenElute™ 5ute Plasmid Miniprep Kit (250 preps)
PLX15	GenElute™ Plasmid Maxiprep Kit (15 preps)
PLD35	GenElute™ Plasmid Miniprep Kit (35 preps)

Szczegółowy protokół transformacji przy użyciu komórek chemo- lub elektrokompetentnych można znaleźć tutaj.

Screening

Oferujemy szereg chromogennych substratów, które wspomagają screening rekombinowanych bakterii. Niektóre produkty mogą być stosowane do rozprowadzania na płytkach agarowych LB (protokół przesiewowy 1), podczas gdy inne są włączane do pożywki mikrobiologicznej (protokół przesiewowy 2). Produkty są używane wraz z IPTG tam, gdzie jest to wymagane. Protokoły dla obu procedur podano poniżej.

Protokół przesiewowy 1 (dotyczy produktów o numerach B6650, 16658, B2904, B3928, 16669, B8931)

• Rozprowadź 40 µL lub odpowiednią ilość roztworu podstawowego substratu chromogennego i 10 µL roztworu IPTG na płytkach z agarem LB za pomocą sterylnego rozsiewacza (dodanie IPTG w przypadku stosowania produktu numer B3928 nie jest wymagane, ponieważ zawiera on już IPTG).
• Płytki powinny zawierać te z odpowiednim antybiotykiem i bez antybiotyku jako kontrole.
• Pozostaw płytki do wyschnięcia w komorze z przepływem laminarnym z lekko otwartymi pokrywkami.
• Rozprowadź 10-100 µL transformowanych E. coli na płytki z agarem LB za pomocą sterylnego rozsiewacza.
• Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 24-48 godzin.
• Na powierzchni agaru pojawiają się niebieskie i białe kolonie. Wybierz rekombinowane komórki w białych koloniach do hodowli.

Protokół przesiewowy 2 (dotyczy produktów o numerach S7313, S9811, C4478)

• Przygotuj agar LB, odważając odpowiednią pożywkę w proszku, agar i wodę w sterylnej kolbie. Alternatywnie, odważyć odpowiednią ilość C4478 i dodać do wody w sterylnej kolbie.
• Dodaj 300 mg/L produktów o numerach S7313 i S9811 oraz 500 mg/L cytrynianu amonowo-żelazowego (numer produktu F5879) do pożywki przed autoklawowaniem. Unikaj tego kroku, jeśli C4478 jest używany.
• Autoklawuj pożywkę i ostudź na tyle, aby móc obsługiwać kolbę.
• Dodaj odpowiednie stężenie wybranego antybiotyku do pożywki.
• Wlej około 25-30 ml agaru LB na sterylne płytki i pozostaw do zastygnięcia z lekko otwartymi pokrywkami.
• Nanieś 10-100 µl transformowanych komórek E. coli na płytki z agarem LB za pomocą sterylnego rozsiewacza.
• Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24-48 godzin.
• Na powierzchni agaru pojawiają się niebieskie i białe kolonie. Wybierz rekombinowane komórki w białych koloniach do hodowli.

Rysunek 3. Wybór niebiesko-białego koloru rekombinowanych bakterii przy użyciu X-gal.

Ograniczenia niebiesko-białych badań przesiewowych

• Technika niebiesko-biała jest tylko procedurą przesiewową; nie jest techniką selekcji.
• Gen lacZ w wektorze może czasami być niefunkcjonalny i może nie wytwarzać β-galaktozydazy. Powstała kolonia nie będzie rekombinowana, ale będzie wyglądać na białą.
• Nawet jeśli niewielka sekwencja obcego DNA może zostać wstawiona do MCS i zmienić ramkę odczytu genu lacZ. Skutkuje to fałszywie pozytywnymi białymi koloniami.
• Niewielkie wstawki w ramce odczytu lacZ mogą powodować niejednoznaczne jasnoniebieskie kolonie, ponieważ β-galaktozydaza jest tylko częściowo inaktywowana.

Referencje

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Padmanabhan S, Banerjee S, Mandi N. Screening of Bacterial Recombinants: Strategies and Preventing False Positives. https://doi.org/10.5772/22140